選擇色譜柱之后，下一個最重要的決定就是準確選擇將進入流動相的物質。如上所述，SEC分離的基本原則之一是應選擇條件，以使保留（化學意義上）最小。如果實現了此方法，則可確保洗脫體積是分子大小的指標。乍一看，這似乎應該很簡單-我們應該選擇一種固定相，該固定相不會通過與分析物的特定類型的相互作用而強烈地相互作用，然后選擇一種流動相，其中分析物具有很高的溶解度并且能夠最小化分析物與固定相的相互作用。但是，如果我們從50年的液相色譜學中學到了什么，最大的經驗教訓之一就是，固定相或分析物的化學性質或結構上的細微變化都可能導致保留率發生較大變化。確實，在開發新方法時，我們經常在反相分離中充分利用這些相互作用。但是，實施此方法還意味著在蛋白質的SEC分離中實現“無保留”條件可能非常困難。有大量的文獻描述了研究，這些研究探索了使用不同的流動相改性劑和條件以最小化固定相與分析物之間的相互作用。