通過CsCl等密度梯度離心純化λ噬菌體顆粒實驗

λ 噬菌體懸浮液

CsCl乙醇

Beckman SW41 或 SW28 轉子或相當型號Beckman Ti50 或 SW50.1 轉子或相當型號皮下注射用針頭

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) CsCl（固體）

(2) CsCl 溶液



(3) 乙醇

2. 離心機和轉子

(1) Beckman SW41 或 SW28 轉子或相當型號

(2) Beckman Ti50 或 SW50.1 轉子或相當型號，配有清亮的離心管（如 Beckman 超亮離心管）

3. 專用設備

皮下注射用針頭（21號）

4. 載體和菌株

λ 噬菌體懸浮液

二、方法

1. 測定噬菌體懸浮液的體積，每毫升加入 0.5 g 固體 CsCl，攪拌混勻使其完全溶解。

2. 倒入足夠量的 CsCl 分級梯度，使噬菌體懸浮液分成幾個組分，每個梯度能容納約 16 ml 噬菌體懸浮液。所需分級梯度的量等于親水相的最終體積（步驟1），親水相又被分成數份，每份為 0.4 X 離心管體積。用適合于 Beckman SW41 或 SW28 轉子（或相當型號）的清亮塑料離心管（如 Beckman 超亮離心管)。



3. 在 ρ=1.50 g/ml 和 ρ=1.45 g/ml 兩層界面的相應試管壁外側，用永久性標簽筆作上標記。



CsCl 分級梯度大約占超離管體積的 60%。比如，對一個能裝 38 ml 的 Beckman SW28 試管（或相當型號），分級梯度由三種均為 7.6 ml 的 CsCl 溶液組成。平衡管裝有同樣密度的 CsCl 溶液。

4. 小心地將噬菌體懸浮液加至分級梯度上，4℃，87000 g ( 22000 r/min 于 Beckman SW28 轉子中）離心 2 h。

5. 按下面的方法對離心管進行穿孔，以收集噬菌體顆粒。

(1) 用酒精仔細地擦去離心管外的油污，然后在離心管的外側貼上 Scotch 膠帶，與噬菌體顆粒帶平齊。

膠帶起到封條的作用，防止針頭四周滲漏。

(2) 用 21 號皮下注射用針頭（不需要注射針筒）穿過膠帶刺入離心管，收集噬菌體顆粒帶。



手指遠離針頭刺入方向，以免剌穿離心管。注意不要使梯度中其他帶內物質污染噬菌體顆粒。這些帶內含有細胞碎片和未裝配的噬菌體成分。

6. 將噬菌體顆粒懸浮液裝入適宜于 Beckman Ti50 或 SW50.1 轉子（或相當型號）的超離管中，加入 CsCl 溶液（ρ=1.5 g/ml 于 SM 中)。4℃，150000 g ( 41000 r/min 于 Beckman Ti50 轉子中）離心 24 h 或 160000 g ( 36000 r/min 于 Beckman SW50.1 轉 子中）離心 24 h。



7. 如步驟 5 所述收集噬菌體顆粒帶，于 CsCl 溶液中 4℃ 密封保存于一試管中。

8. ( 可供選擇）如果必要，噬菌體顆粒可通過新一輪的 CsCl 平衡梯度離心進一步純化和濃縮。將噬菌體懸浮液轉移至適宜于 Beckman SW50.1 轉子（或相當型號）的一個或多個超離管中，加入 CsCl 溶液（ρ=1.5 g/ml 于 SM 中），160000 g ( 36000 r/min 于 Becrkman SW50.1 轉子中）4℃ 離心 24 h。當離心完成后，如下面“替代方案”的步驟 3 和 4 所述收集噬菌體顆粒。