酪蛋白激酶分析實驗

實驗方法原理

實驗材料 β-酪蛋白（溶于水）有酪蛋白激酶活性的酶樣品

試劑、試劑盒 [γ-32P] ATP 溶液酪蛋白激酶反應緩沖液TCA SDS-PAGE 樣品緩沖液

儀器、耗材 30℃ 水浴P81 磷酸纖維素膜離心管離心機

實驗步驟

1. 每個鑒定反應按以下比例將各反應組分加入 1.5 ml 微量離心管中：

4 μl 5 × 酪蛋白激酶反應緩沖液

1 μl 10 mg/ml β-酪蛋白

1 μl [γ-32P] ATP 溶液（ATP 終濃度為 5 μmol/L， 放射活性為 5 μCi/μl）

1～14 μl 水

蓋好離心管，混勻，放入 30℃ 水浴溫育 10 min。

2. 加入 1～14 μl 有酪蛋白激酶活性的酶樣品開始反應。

3. 30℃ 水浴，10 min。

4. 按不同的分析方法加入適當的試劑停止反應：加入 20 μl 10 % 的預冷 TCA 進行 TCA 沉淀，或 10～20 ml 預冷的 2 × SDS-PAGE 樣品緩沖液進行電泳分析。用那些方法中的一種繼續進行分析。

注意事項

1. 對于 Cr 酪蛋白也可使用該反應混合物。每個反應的容積為 20 μl。在步驟 2 中加入水的量取決于所用酶樣品的多少。

2. 加入酶量的容積取決于樣品中酶活性的大小。在預試驗中所得的最大反應值可衡量磷酸轉移反應的程度。在反應中為了保持磷酸基與底物的線性結合關系可適當減小酶的加量。