酵母前體mRNA剪接提取物實驗

tRNAUTPRNA 聚合酶

YPTris-HClETDASDS甘油HEPES 鉀鹽DTTPMSF磷酸鉀緩沖液D-山梨醇SB 緩沖液等滲液裂解液AGK 緩沖液TBETE亞精胺轉錄緩沖液NTPATP二氯乙酸乙酸鈉RNA 洗脫緩沖液乙酸銨乙醇染色液蛋白酶 K 溶液乙酸鈉-EDTA 溶液Tris 堿平衡酚過硫酸銨硅烷化溶液RNasin

離心機搖床Dounce 勻漿器瓷質研缽研杵透析袋Dewar 燒瓶防低溫手套真空濾膜架電源玻璃板聚四氟乙烯梳子和墊片黃色膠帶聚丙烯培養試管Quicksep 柱臺式振蕩器旋轉真空濃縮儀

一、材料與設備

1. 剪接提取物制備用溶液

除非另有說明，所有溶液均以蒸餾水制備。

(1) YP：加 20 g 酵母提取物和 40 g 蛋白胨（hacto peptone ) 到 1 L 的去離子水或者蒸餾水中。加 50 g 無水 D-葡萄糖到 70 ml 水中并在加熱盤上攪拌溶解，用水補充至 100 ml 以制備 50% ( m/V ) 的葡萄糖溶液。將 YP 在一帶塞的 2800 ml Fcrnbach 燒瓶或者 4 L 燒瓶中高壓滅菌，50% 葡萄糖存放在帶螺絲帽的瓶中，于室溫儲存。使用前每升 YP 加 40 ml 的 50% 葡萄糖。葡萄糖在高壓火菌后再加入 YP 中，以防止因高壓滅菌過久而焦糖化。

(2) 1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.6，pH 7.8 和 pH 8.0）：加 30.29 g Tris 堿到 125 ml 水中，接著加入 92 ml 1 mol/L HCl。用 1 mol/L HCl 滴定調 pH 至 7.6，7.8 或者 8.0，加水至 250 ml。高壓滅菌后室溫保存。

(3) 4 mol/L NaCl，高壓滅菌后室溫保存。

(4) 0.5 mol/L ETDA ( pH 8.0 )：加 18.6 g 的 EDTA ( 二鈉二水合物形式）到 75 ml 的水中溶解 EDTA 并用 10 mol/L NaOH 將 pH 調至 8.0。加水至 100 ml。高壓滅菌后室溫保存。

(5) 10%（m/V）SDS，室溫保存。

(6) 50%（m/V）甘油，高壓滅菌后室溫保存。

(7) 1 mol/L MgCl₂，高壓滅菌后室溫保存。

(8) 2 mol/L KCl，高壓滅菌后室溫保存。

(9) 1 mol/L HEPES 鉀鹽（HEPES-K⁺），23℃ 時 pH 為 7.8：加 119.2 g HEPES 和 20.1 g KOH 到 400 ml 的水中，加水至總體積 500 ml。稀釋一小份樣品到 10 mmol/L，檢測 23°C 時其 pH 是否為 7.5，必要時可用 2 mol/L HCl 調節 pH。在 4℃ 其 pH 應為 7.8。高壓滅菌或者過濾除菌后于 -20℃ 保存。溶液在高壓滅菌后可能有點發黃，但不影響使用。

(10) 1 mol/L DTT：DTT 固體儲存在 -20°C，該溶液保存于 4℃，應該在 24 h 內使用。

(11) 0.5 mol/L PMSF，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.6）：慢慢將 8.85 g KH₂PO₄ 和 75.75 g K₂HPO₄ 加入到 400 ml 水中，溶解后，其 pH 應該是7.6，然后把總體積調到 500 ml 并高壓滅菌。室溫保存。

(13) 酶解酶溶液 ( zymdyase)：用 20 mmol/L 磷酸鉀、5% 葡萄糖的緩沖液配制 20 mg/ml ( pH 7.6 ) 的酶解酶溶液，用前配制。酶解酶-100T ( 100000 U/g ) 固體于 4°C 儲存。從 1 L 的細胞培養物中制備提取物需 10 mg 的酶解酶。酶解酶不能完全溶解，但不影響使用。

(14) 2 mol/L D-山梨醇：高壓滅菌，室溫保存。

(15) SB 緩沖液：1 mol/L 山梨醇，50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.8），10 mmol/L MgCl₂，室溫保存。加 1.5 ml 的 1 mol/L DTT 到 50 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+30 mmol/L DTT。加 0.75 ml 的 1 mol/L DTT 到 250 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+3 mmol/L DTT。

(16) 等滲液：1 mol/L 山梨醇，以水稀釋 2 mol/L 山梨醇至 1 mol/L。

(17) 裂解液：0.1%（m/V）SDS，50 mmol/L EDTA。

(18) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，20 mol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。新鮮制備并置于冰上。加 1 ml 的 1 mol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，150 μl 1 mol/L MgCl₂，1 ml 2 mol/L KCl 和 50 μl 1 mol/L DTT 到97 ml 的滅菌水中，僅在使用前才加入 100 μl 0.5 mol/L PMSF。注意 PMSF 在水溶液中的半衰期大約為 30 min。加入 PMSF 時會產生少量沉淀但不影響使用。

(19) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.8)，0.2 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20% 甘油( V/V )，1 mmol DTT，0.5 mmol/L PMSF，從 1 L 細胞培養物中制備提取物，須提前一天準備 2 L 的緩沖液 D。高壓滅菌，置冷室冷卻過夜。在透析前加 1 ml 1 mol/L DTT 和 1 ml 0.5 mol/L PMSF。

(20) AGK 緩沖液：10 mmol/L HEPES-K⁺ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl₂，200 mmol/L KCl，10% （V/V）甘油，0.5 mmol/L DTT 和 0.5 mmol/L PMSF。使用前才加 PMSF。

2. 體外轉錄和剪接分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA（pH 8.3）。室溫保存。

(2) 1X TBE：用蒸餾水或者去離子水稀釋 10XTBE 至 1XTBE，室溫儲存。

(3) 1XTE：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6 )，1 mmol/L EDTA。室溫儲存。

(4) 30%（m/V）PEG₈₀₀₀，50℃ 加熱溶解，高壓滅菌，溶液冷卻后分裝為每份 1 ml 和 10 ml，于 -20℃ 儲存。

(5) 1 mol/L 亞精胺：1.27 g 三鹽酸亞精胺（spermidine trihydrochloride ) 溶于 3.5 ml 滅菌水中，用 10 mol/L NaOH 調整 pH 至 7.6，加水到 5 ml。-20℃ 保存。

(6) 10X 轉錄緩沖液：0.4 mol/L Tris-HCl（pH 7.8)，60 mmol/L MgCl₂，40 mmol/L 亞精胺。500 μl 每份儲存于 -20℃。

(7) 0.1 mol/L DTT：用水稀釋 1 mol/L DTT 至 0.1 mol/L，500~750 μl 每份儲存于 -20℃。

(8) 10X NTP：ATP、GTP、CTP 各 5 mmol/L，UTP 1 mmol/L( pH 7.0)，儲存于 -20℃ 使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。

(9) 100 mmol/L ATP：儲存于 -20℃。使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。

(10) 二氯乙酸（TCA)：將 500 g TCA 加入 227 ml 的水中制備 100% TCA。在量筒中分別稀釋 10 或 20 倍以制備 10% 和 5% 的 TCA。

(11) 3 mol/L 乙酸鈉（NaAc) ( pH 5.4)：加 40.82 g 的二水乙酸鈉至 75 ml 水中，加冰乙酸調 pH 到 5.4，最后加水至 100 ml。高壓滅菌，室溫保存。

(12) RNA 洗脫緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6)，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，2% ( V/V ) 苯酚（Tris EDTA 或 NaAc-EDTA 平衡），4°C 保存。

(13) 7.5 moI/L 乙酸銨（NH₄Ac）：用 0.2 μm 孔徑的濾器除菌，4°C 保存。

(14) 70% ( V/V ) 乙醇：室溫儲存。

(15) 染色液：10% 溴酚藍，10% 二甲苯藍，室溫保存。染料可能不完全溶解，但不影響使用，使用前用力搖晃。

(16) 去離子甲酰胺，pH 大于或等于分裝成 1~10 ml 每份，于 -20°C 儲存。儲存超過 6 個月時須檢查其 pH，如果 pH 低于 6.5 需進行去離子處理。

(17) 轉錄產物上樣緩沖液：98% 甲酰胺，50 mmol/L EDTA，溴酚藍和二甲苯藍各 0.1%。-20℃ 儲存。

(18) 蛋白酶 K 溶液：2.5 mg 蛋白酶 K 溶于 1 ml 4% ( m/V) SDS、50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.8)，0.25 moI/L EDTA 混合物中。1 ml 每份儲存于 -20°C。

(19) tRNA：于 10 ml 的無菌水中溶解 100 mg 的 E.coli tRNA，0.5~1 ml 每份，儲存于 -20℃。

(20) 剪接分析終止緩沖液：混合 200 μl 的 tRNA 和 1 ml 的蛋白酶 K 溶液。0.2~0.5 ml 每份，儲存于 -20℃，使用時在 37℃ 融化并保持在 23~25℃ 以防止使用時 SDS 沉淀。

(21) 剪接分析用上樣緩沖液：0.1X TBE，8 mol/L 尿素，溴酚藍和二甲苯藍均為 0.1%。加 0.22 g 尿素（超純）到 200 μl 無菌水中，65℃ 加熱使尿素溶解。加此尿素溶液 200 μl 至 94 μl 水、3 μl 的 10X TBE 和 3 μl 染色液（10% 溴酚藍，10% 二甲苯藍）中，此緩沖液需當天使用。

(22) 乙酸鈉-EDTA 溶液：300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaAc ( pH 5.4)，100 mmol/L EDTA。室溫儲存。

(23) 1 mol/L Tris 堿，高壓滅菌后在室溫儲存。

(24) Tris-EDTA 平衡酚，4°C 可儲存 1~2 天，長期儲存應凍存于 -20°C。當有機相變成淡橙色時應棄用。

(25) NaAc-EDTA 平衡酚：65℃ 加熱 500 g 分子生物學級的酚并加入 0.5 g 8-羥基喹啉，然后加入 500 ml 300 mmol/L NaAc ( pH 5.4)、50 mmol/L EDTA 溶液，用攪拌器快速混合 10 min，停止攪拌并讓液體分成水相與有機相，吸棄上層的水相，再加入 100 ml 300 mmol/L 新配制的 NaAc ( pH 5.4) 和 50 mmol/L EDTA，快速攪拌 5 min，靜止使液體分相，并吸棄大部分的上層水相，無機相上層剩余約 2 cm 厚的水相。4℃ 可儲存 1~2 天，長期儲存應凍存于 -20°C。當有機相變成淡橙色時應棄用。

(26) NaAc-EDTA 平衡苯酚：氯仿：異戊醇：加 20 ml 的異戊醇到 480 ml 的三氯甲烷中，然后將該溶液倒入 500 ml 的用 NaAc-EDTA 平衡的苯酚中，快速攪拌約 5 min，使各相分層，儲存方法同 Tris-EDTA 平衡酚。

(27) 氯仿：異戊醇（24 :1 )：在通風櫥中操作并戴手套，倒 240 ml 的氯仿至一 250 ml 玻璃量筒中，加異戊醇使體積達到 250 ml。儲存于帶蓋玻璃瓶里，通風櫥中存放。

(28) 1X TBE、8 mol/L 尿素：加 240.2 g 尿素到 250 ml 溫水和 50 ml 10X TBE 中。低溫加熱攪拌至尿素溶解，將溶液倒入量筒中，冷卻后加水補充至 500 ml，于 4℃ 儲存。若有尿素沉淀于 37℃ 水浴加熱溶液至尿素溶解。

(29) 用 1X TBE、8 mol/L 尿素配制丙烯酰胺[ 29%（m/V）丙烯酰胺，1%（m/V）甲叉雙丙烯酰胺 ]：為得到 5%（m/V）丙烯酰胺溶液，加 12.1 g 丙烯酰胺（電泳級）和 0.4 g 的甲叉雙丙烯酰胺到 250 ml 的 1X TBE、8 mol/L 尿素中，攪拌至丙烯酰胺完全溶解。制備 7.5%( m/V ) 丙烯酰胺溶液，加 18.12 g 的丙烯酰胺（電泳級）和 0.63 g 的甲叉雙丙烯酰胺到 250 ml 的 1XTBE、8 mol/L 尿素中并攪拌至丙烯酰胺完全溶解。兩種丙烯酰胺溶液于 4℃ 在帶螺帽的瓶中可儲存一年。如果儲存期間出現沉淀，在 37℃ 水浴加熱直至沉淀溶解。

(30) 10%( m/V）過硫酸銨（APS ) 和 TEMED，過硫酸銨 4°C 可儲存 1 周；TEMED 儲存于 4℃。

(31) 硅烷化溶液：15%（V/V）二氯二甲硅烷溶解于氯仿中。儲存于磨口玻璃瓶中，于通風櫥中存放。

(32) 2%（m/V）NaHCO₃。

(33) 15%（V/V）甲醇，5%（V/V）乙酸，在帶螺帽的瓶中室溫儲存。

3. 制備提取物用的設備和材料

(1) 搖床：要求能使用大的燒瓶，轉速達 300 r/min 并能維持在 30℃，以培養酵母細胞。

(2) 離心機：具有適當轉子的微型高速臺式（或者臨床用）離心機和超速離心機。

(3) 玻璃或金屬的 Dounce 勻漿器。

(4) 12.7 cm 的瓷質研缽和研杵：初次使用時，用鉻酸溶液處理研缽和研杵 15~30 min，然后用水徹底清洗。在研缽中注滿 AGK 緩沖液，將研杵放入研缽，室溫放置 30 min。最后用滅菌的蒸餾水徹底清洗研缽和研杵并風干。使用時用去離子水清洗，然后用滅菌的蒸餾水清洗并風干。

(5) 透析袋（1.27 cm 寬，截留分子質量>3500 Da）和 4 cm 透析袋夾。實驗前一天按如下步驟處理透析袋：剪成 30 cm 長的條，在 4 L 的 2% 碳酸氫鈉中煮沸 15 min，用大量的滅菌水洗 3 次。在緊密封閉的容器里，處理過的透析袋在 70% 乙醇中于 4℃ 可存放幾年以上。在使用透析袋之前約 15~30 min，從乙醇中取出并擠掉過多的液體，在幾百毫升的滅菌水中浸泡，然后用更多的滅菌水清洗。用 10~12 ml 新鮮的滅菌水沖洗透析袋內側兩次，浸入冷的緩沖液 D 中。

(6) 兩個 350 ml Dewar 燒瓶。

(7) 0.5~10 L 液氮（N₂）。

(8) 防低溫手套。

(9) 一個超低溫（-70~-80℃）冰箱或液氮罐。

4. 體外轉錄和剪接分析用設備和材料

(1) [ α-³²P ] 尿苷三磷酸（UTP)：3000 Ci/mmol 和 10 mCi/ml。

(2) T7 或者 SP6 RNA 聚合酶。

(3) RNasin：40 U/μl。

(4) 支持 24 mm 過濾器的鋼制真空濾膜架。

(5) Whatman 玻璃纖維（GF/C）24 mm 濾紙。

(6) 電源：可維持穩定的高達 1000 V 的電壓和 100 mA 的直流電。

(7) 兩塊玻璃板（4 mm 厚）：一塊尺寸為 19 cm 寬、16 cm 高，另一塊尺寸相同，但有一 2.2 cm 深、16.3 cm 寬的槽。

(8) 聚四氟乙烯梳子和墊片。為純化轉錄物，墊片和梳子應為 1.5 mm 厚，梳子 16 cm 寬、3 cm 高，7 個齒，齒間間隔為 2 mm，每個齒 1.4 cm 高、1.8 cm 寬，每個齒形成的孔最大體積 80 μl。用于剪接分析的梳子和墊片是 0.38 mm 厚，梳子 15.5 cm 寬，2.6 cm 深，14 個齒，齒間間隔為 4 mm，每個齒 8 mm 高、7 mm 寬，每個齒形成的孔可容納 15 μl。

(9) 黃色膠帶。

(10) 一次性帶帽的無菌聚丙烯培養試管（12 mm X 75 mm 或 17 mm X 100 mm）和一次性帶螺帽的無菌刻度圓錐形聚丙烯離心管（50 ml）。

(11) 空的 Quicksep 柱（Empty Quicksep columns）（Isolab、Inc、Akron、OH、USA）。

(12) X 射線片（20.32 cm X 25.4 cm），避光 X 射線片暗盒，增感屏，X 射線片處理設備。

(13) 硅烷化并烤過的玻璃棒、Corex 試管。

(14) 臺式振蕩器。

(15) 旋轉真空濃縮儀（Spced-Vac concentrator）或凍干器。

(16) 3 MM Whatman 濾紙（46 cm X 67 cm）。

(17) 凝膠干燥器（可選）。

二、操作方法

1. 勻漿原生質球獲取整細胞提取物

為盡可能得到有最大活性的提取物，要以最快的速度操作直至透析。

(1) 1 L 的酵母細胞培養物過夜培養到對數生長期的中后期。首先在 125 ml 或者 250 ml 的燒瓶中過夜培養 10~50 ml 酵母，第二天將其轉移到 1 L YPD 中。使培養物在 30℃，以轉速 250~300 r/min 培養過夜，使其密度達到 3X10⁷~5X10⁷/ml。對于酵母菌株 EJ101，30℃ 用 YPD 培養，倍增時間為 90 min。

(2) 收集酵母細胞。在高速離心機中 1200~1500 g 離心 5 min 收集細胞。采用 100 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重懸細胞并再次離心，再采用 30 ml 的 SB+30 mmol/L DTT 重懸細胞沉淀，室溫放置 15 min。在 30 mmol/L DTT 中的孵育對后面的原生質球的形成十分重要。1500 g 離心 5 min，用 30 ml 的 SB+3 mmol/L DTT 重懸細胞并轉入無菌的 120 ml Erlenmeyer 燒瓶。

(3) 酶解酶孵育細胞并監測原牛質球的形成。取 20 μl 兩份細胞，將一份加到 1 ml 的等滲溶液中，另一份加到 1 ml 的裂解液中，通過測 λ₅₀₀ 的光吸收值來監測細胞的裂解。在細胞培養瓶中加入 250 μl 的酶解酶-100T 溶液，30℃ 50~60 r/min 緩緩搖 40 min。每 10~15 min 取出 20 μl 兩份，分別加入 1 ml 的等滲溶液和裂解液中，測 λ₅₀₀ 的吸收值以監測原生質球的形成。當裂解液中的光吸收值為等滲溶液中光吸收值的 20% 或更少時，表明酶解達到要求。

(4) 此前一步操作均需在冷室中進行以保持樣品冷卻。設備（包括吸管、轉子和溶液）均要在冷室中過夜預冷。

(5) 勻漿裂解原生質球。用一無菌硅烷化的玻璃棒輕輕地使原牛質球重懸于冷的緩沖液 A 中，1 L 培養物（4X10⁷~5X10⁷ 細胞/ml）用 8 ml 緩沖液 A。然后將原生質球轉移到一冷的 7 ml 或者 14 ml Dounce 勻漿器中，勻漿器置于冰上勻漿 5~10 次。

(6) 0.2 mol/L 氯化鉀處理勻漿液以從核中釋放剪接因子。勻漿液倒入 15 ml 帶刻度的一次性無菌圓錐離心管中，記下勻漿液的體積。如果在勻漿液中有大量氣泡，用冷卻的臺式離心機短暫離心（2 min）以消除氣泡。勻漿液倒入置于冰上的帶有一個小攪拌子的 25 ml 玻璃燒杯中，緩緩攪動（約 60~120 r/min）10 min。用吸頭慢慢（2 min）加入 0.9 倍體積冷的 2 mol/L KCl 至終濃度為 0.2mol/L，再緩緩攪動 30 min。

(7) 通過兩次離心沉淀細胞碎片和細胞器，將勻漿轉移到 10 ml 或者 30 ml 的螺帽 Oak Ridge 試管并在 4℃ 以 33000 g 離心 30 min 以沉淀大的碎片。在冷室從轉子中取出試管，吸取上淸轉移到一個厚壁聚碳酸酯的帶螺帽試管中，然后于 4℃ 100000 g 離心 1 h。

(8) 透析提取物。把離心機轉子移到冷室中，小心取出試管并放到試管架上，打開蓋子。樣品分為三層：薄的上層包括脂類和脂蛋白；厚的中間層為澄清的淡黃綠色，包括大部分的剪接活性物質和一些核糖體；底層則為清晰的淡棕色，包括細胞器、核糖體和大的細胞碎片。從緩沖液 D 中取出透析袋，戴上手套，擠掉多余的液體，以夾子封閉一端。用冷的無菌巴斯德吸管吸取黃綠色的中間層液體，小心操作，避免吸到上層或底層。提取物吸到透析袋中，約 6~8 ml。擠去袋中的空氣，用夾子在接近提取物的地方夾住透析袋。將透析袋置于一個裝有 1 L 緩沖液 D 和一個無菌磁力攪拌子的無菌燒杯中。將燒杯放在冰槽中，周圍放上冰，冰槽則放在冷室中的磁力攪拌器上。1.5 h 后更換緩沖液 D，共攪拌透析 3 h。提取物更多時可增加緩沖液 D。

(9) 離心去除透析時產生的沉淀。透析后，提取物的量可能減少 1~2 ml，從透析緩沖液中取出透祈袋，用紗布擦去袋外的液體，打開上端的夾子，用一冷的無菌巴斯德吸管吸出提取物轉移到一冷的 Oak Ridge 試管或者幾個冷的微量離心管中。在 4℃ 以 12000~14000 g 時離心 10 min。

(10) 保存提取物。以每管 100 μl，200 μl 或者 500 μl 將提取物分裝到置于冰上的微量離心管或凍存管中。快速冷凍后在液氮或者 -70℃ 冰箱中保存。

(11) 1 L 酵母培養物可得到 6 ml 提取物，每毫升約含蛋白質 20~30 mg。

2. “冷凍斷裂” 法獲得全細胞提取物

(1) 如上所述方法培養酵母細胞。以 1500 g 在 4℃ 離心 10 min 收集細胞。

(2) 準備細胞。將細胞在 50~100 ml 冷的 AGK + PMSF 緩沖液中重新懸浮，在 4℃ 以 1500 g 離心 10 min，從這一步開始樣品要保持冰冷。倒出上清并加入 20 ml 新配制的冷 AGK+ PMSF 緩沖液重懸浮細胞，將細胞懸液轉移至無菌的 50 ml 聚丙烯刻度