利用一個假定的突變通過互補作用克隆酵母菌基因的一般方法。該突變為cdc101-1，它對酵母菌的生長來說既是隱性的又是溫度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生長，而不能在37°C形成菌落。如果用一個酵母菌基因組文庫轉化cdc101-1菌株，通過分離溫度不敏感菌落，那么就可能分離到一個可以互補這種突變的酵母菌基因。分離到溫度不敏感菌落后，必須采取兩個步驟來證明在這種轉化到cdc101-1菌株中的質粒含有野生型cdc101基因。第一步，假如這種觀察到的互補現象是由質粒引起的，而非cdc101-1回復突變造成，互補質粒的分離必定導致質粒所帶的選擇標志及互補表型同時消失。第二步，必須排除是否被克隆的基因編碼了這種突變的表型抑制基因的情形，而非野生型基因編碼。這些均可通過互補實驗來實現，并且可證明一個整合到基因組中的克隆基因的破壞是否能夠互補原有的突變。來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版
| 實驗方法原理 | 在非選擇性生長條件下，大多數大腸桿菌/酵母菌穿梭載體的丟失頻率大約1%。 在本方案中含質粒的酵母菌株接種于非選擇性平板上以分離質粒并可得到單菌落。然后通過影印到選擇性平板上可以鑒別丟失了質粒的菌株 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1) 挑取幾個含質粒的酵母菌單克隆，分別接種于10 mL非選擇性培養基，30℃培養過夜。如果沒有其他的選擇，可以用YPD培養基，如果要保留其他不穩定遺傳標志或質粒，可以用添加了與可能丟失的可選擇標志相應的營養成分的確定成分培養基。 2) 涂布在相應的非選擇性平板上以得到單菌落，30℃培養2天。 3) 影印到選擇性平板上以確定丟失了質粒選擇標志的菌落。將選擇性平板和非選擇性主平板置30℃培養過夜。 |