1. 酵母在YPD（或選擇性）培養基中劇烈振蕩下培養至對數中期。離心，棄上清，市售酵母糕可以用來代替培養細胞。
2. 在旋渦混合器上振蕩細胞沉淀，使其形成粘稠的細胞糊，必要時，加入最少量的冰水使細胞糊能夠倒出或舀出，如果使用酵母糕，用等體積的細胞和水混合使之形成粘稠的細胞糊。在后續步驟中細胞糊的操作應在冰浴中進行。
3. 拔出60 ml 注射器的活塞，用塞子塞住底部或者用Parafilm 膜包緊，加入50 ml的細胞糊。 4. 往1 L Nalgene 燒杯中加入400 ml 液氮，將注射器懸于液氮之上，除去底部的塞子或Parafilm 膜，插入活塞，將細胞糊推入液氮中。粘稠的細胞糊會形成長而細的條狀物，稀的細胞糊會形成爆米花樣的團狀物，使用1 L 的混合杯一次最多可處理約200 ml 細胞糊，破菌之前冰凍細胞可于-80℃無限期貯存。
5. 小心將液氮連同冰凍細胞倒入已裝好混合器的混合杯中，用前必須徹底干燥（必要時可以在室溫下進行）。 6. 蓋上混合杯的蓋子，確定蓋孔是打開的，這樣液氮蒸發時不會造成壓力，將蓋子蓋緊，髙速連續攪拌3次，每次2 min。在攪拌間隙可混勻冰凍粉，必要時加入液氮剛好覆蓋住冰凍粉，倒入液氮之后要盡快開始攪拌以避免凍住可動部分。
7. 攪拌后，將細的冰凍粉倒入盛有兩倍于原來細胞糊體積的冰冷的貯存緩沖液的燒杯中，混勻后將懸液倒入離心管置于冰上。
8. 重復步驟3~7，直到處理完所有的細胞糊。
9. 于5 000 g 離心15 min，上清為含蛋白10~20 mg/ml 的粗提液。 展開 | 