1.HRP的底物
作為供氫體的底物化合物較多，常用的有以下幾種：
（1）鄰苯二胺（OPD）：OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一。0PD在HRP的作用下顯橙黃色，加強酸如硫酸或鹽酸終止反應后呈棕黃色，最大吸收峰在492nm波長。OPD是ELISA中應用最早的底物，但其應用液穩定性差，易變色，需新配制后在1小時內使用，顯色反應過程需避光，而且具有致癌性。
（2）四甲基聯苯胺（TMB）：TMB是一種優于OPD的新型HRP色原底物。TMB經HRP作用后變為藍色，加入硫酸終止反應后變為黃色，最大吸收峰波長為450nm。TMB具有穩定性好，成色無需避光，無致突變作用等優點，已成為目前ELISA中應用最廣泛的底物。缺點是水溶性差。
（3）其他：5-氨基水楊酸（5-ASA）和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）也是HRP常用的底物。
2.AP的底物
常用對-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP經AP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。
3. β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物 常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高強度熒光物4-甲基傘形酮（4-MU），其敏度性較HRP高30～50倍，但測量時需用熒光計。