實驗概要
本實驗介紹了酶標記抗體-HRP標記抗體中的戊二醛二步法的操作流程。
實驗原理
戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
主要試劑
1. 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
2. 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
3. 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
4. 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
5. 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
6. PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
7. 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
8. 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
9. HRP(RZ>3.0)。
主要設備
1. Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
2. 攪拌器，分光光度計，離心機。
3. 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
實驗步驟
1. 稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
2. 反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3. 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4. 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3小時。
5. 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
6. 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
7. 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
8. 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
9. 結果判定：
1) 定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定
2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
3) 本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質結合。