重組白細胞介素4（IL4）蛋白表達和純化研究

白細胞介素4（IL-4）是具有多種免疫學調節功能的細胞因子，具有廣泛的生物學活性，臨床及研究中需要大量高純度的IL-4，以及其高效檢測試劑。而進行IL-4重組蛋白表達與純化研究，制備高純度、高活性的IL-4蛋白對于研究IL-4的生物學功能至關重要。研究表明，糖基化對IL-4的生物學活性可能沒有影響，且大腸桿菌表達的IL-4其生物學活性與哺乳動物細胞的表達產物相當，這使人們有可能用原核表達的方式大量生產具有生物學活性的IL-4。

1、人IL-4重組蛋白表達與純化研究

我國有研究者構建人IL-4重組表達載體，表達純化并鑒定人IL-4重組蛋白。采用巢式PCR技術從健康志愿者外周血單核細胞(PBMC)總RNA中擴增人IL-4開放閱讀框基因，將擴增的IL-4目的基因與表達質粒pET101/D-TOPO連接，轉化大腸桿菌BL21，進行表達純化和鑒定。

結果采用巢式PCR擴增得到IL-4開放閱讀框大小為460bp，測序比對顯示序列正確。轉化BL21后，通過對不同克隆子表達水平的篩選，篩選到高表達IL-4的克隆子，表達和純化后聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)顯示，其融合蛋白大小約為28×103，與目的蛋白大小一致。western印跡分析法鑒定結果顯示表達的蛋白正確，為人IL-4目的蛋白。因此成功表達純化到人IL-4重組蛋白。

美迪西生物醫藥在重組蛋白表達與純化服務方面經驗豐富，其擁有多種蛋白表達系統，包括原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統（桿狀病毒）、哺乳動物細胞蛋白表達系統，具備多種融合技術，可以為客戶在蛋白表達與純化方面提供多種選擇。

2、在原核表達載體中，小鼠IL-4重組蛋白表達與純化研究

構建重組小鼠白細胞介素-4(rmIL-4)原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，純化目的蛋白并鑒定。將優化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表達載體pET-32a (+)上，獲得重組質粒pET32/rmIL-4，轉入BL21(DE3)中經IPTG誘導表達得到包涵體。經復性處理后，依次用陰離子交換柱和分子篩純化蛋白。

對純化得到的蛋白用western印跡分析法檢驗免疫學特異性，用mIL-4生長依賴性細胞株CTLL-2增殖實驗和動物實驗測定其生物學活性。結果發現經酶切和測序證實重組質粒pET32/rmIL-4構建成功，誘導得到的包涵體用3 mol/L鹽酸胍溶液洗滌后溶于加有β-巰基乙醇的7 mol/L鹽酸胍溶液中變性，在pH9.5的條件下梯度透析復性。純化出的蛋白經Western blot鑒定，能與抗小鼠IL-4抗體特異性結合。

經細胞和動物實驗鑒定，rmIL-4蛋白具有生物學活性，能刺激mIL-4生長依賴性細胞株CTLL-2增殖，使小鼠體內細胞因子發生從TH1到TH2的漂移。因此成功制備了高純度、具有生物學活性的小鼠IL-4，為進一步研究其生物學功能提供了條件。

3、在大腸桿菌中，緩釋的抗炎因子IL-4重組蛋白表達與純化研究

有研究者通過大腸桿菌重組表達可以緩釋的抗炎因子白介素4(Interleukin 4，IL-4)。方法是根據小鼠IL-4的氨基酸序列，并基于大腸桿菌密碼子偏愛性合成IL-4的基因，通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法將膠原蛋白結合域(collagen binding domain，CBD)的編碼序列和組氨酸標簽序列連接到IL-4基因上，運用無縫克隆技術將上述重組基因插入p ET-30a(+)載體。重組蛋白通過組氨酸標簽進行純化，純化的蛋白被用于誘導M 0巨噬細胞分化成M 2巨噬細胞，同時檢測M2巨噬細胞相關基因表達以及對白介素10(Interleukin 10，IL10)的分泌。與Ⅰ型膠原蛋白的聯用驗證膠原蛋白對重組因子的吸附和緩釋功能。

結果帶有CBD序列和組氨酸純化標簽的IL-4通過鎳柱純化，具有與商業化IL-4相似的生物活性。功能實驗證實其能夠被膠原蛋白吸附，并能脫離膠原蛋白緩釋。因此通過大腸桿菌表達純化獲得了能夠緩釋的抗炎因子IL-4。

IL-4是一種多效的細胞因子，調節不同的T和B細胞應答，包括細胞增殖，存活和基因表達。IL-4重組蛋白表達與純化研究為進一步研究IL-4的生物學功能提供了基礎。