重組蛋白的高產量瞬時表達

圖a. 用ELISA法測得培養液中IgG的含量；橫軸為天數，縱軸為IgG滴度。

采用高密度瞬時轉染（High-density transfection）的方法，可以在HEK-293 EBNA1細胞中大量表達重組蛋白。實驗表明，該方法具有操作簡單，培養周期短，轉染效率高，批次產量高的優點。

重組蛋白具有極高的經濟價值和科研價值，但是在哺乳動物細胞中使用穩定轉染方法將會消耗大量的時間，而傳統的瞬時轉染方法，在產量上也難以令人滿意。本文介紹的高密度懸浮瞬時轉染的表達方法（Large-scale transient gene expression，TGE）可在較短的時間內大量生產重組蛋白，是一種降低生產強度和節省成本的新方法。

實驗部分

細胞株及主要試劑

HEK-293 EBNA1細胞株（ATCC）；Polyethylenemine（Polysciences, pH7）；Ex-Cell 293培養基（SAFC, 4mM L-glutamine）；Pluronic F68（Sigma-Aldrich）；質粒pEGFP-N1；pEAK8-LH39；pEAK8-LH41。

實驗儀器及耗材

二氧化碳恒溫搖床（Infors）；轉瓶機（IBS）；熒光顯微鏡（Olympus）；生物安全柜（ESCO）；細胞搖瓶（Nalgene）；細胞培養板（Jet）；移液器（Eppendorf）；電動移液槍（IBS）；移液管（Jet）；低速離心機（Sysbery）等。以上儀器和試劑均從上海西域一站式采購而得。

實驗方法

將HEK-293 EBNA1細胞以3×105個/ml的密度接種于Ex-Cell 293培養基中，放置于100rpm搖瓶或75rpm轉瓶中在37℃、5%CO2的環境下培養3天，當細胞密度增為1.5~2×106個/ml，細胞活力大于95%的情況下進行后續的轉染工作。

在無菌環境下取出所有細胞液，以1000rpm的轉速離心5min，棄去所有培養上清并用新鮮的Ex-Cell 293培養基重懸細胞沉淀，同時調整細胞密度為20×106個/ml，將高密度的細胞懸液置于6孔板或小搖瓶中保持低速振蕩狀態以免細胞抱團。

圖b. 用苔盼藍染色法得到的細胞密度及細胞活力；橫軸為天數，左縱軸為細胞密度，右縱軸為細胞活力。

緩慢向細胞液中滴加待轉質粒，用量為50μg/ml；質粒滴加完畢后，同樣緩慢滴加PEI，用量為100μg/ml，將高濃度的轉染細胞液置于搖瓶或轉瓶中振蕩孵育4h。請注意質粒與PEI的滴加次序，如果順序倒置則會降低轉染效率。

孵育完畢后，使用Ex-Cell 293培養基稀釋轉染細胞的密度至1×106個/ml，再加入1%的Pluronic F68完成整個轉染過程。將細胞懸液置于37℃、5%CO2搖瓶或轉瓶的環境中培養5天即可收液。

分別進行單轉pEGFP-N1的實驗組和共轉pEAK8-LH39+pEAK8-LH41（3:7）的實驗組來考察該方法的轉染效率及表達情況。

結果

轉染完畢2天后，細胞密度約為9.3×105個/ml，通過熒光顯微鏡觀測單轉pEGFP-N1質粒細胞組的熒光率，轉染效率約為70%，細胞活力約為88%；培養五天后，細胞密度降為7.3×105個/ml，細胞活力跌至約30%，但共轉質粒組的細胞液中將得到最大的重組蛋白含量，約為25mg/l。

結論

實驗結果表明，本文的高密度瞬時轉染方法具有操作簡單，培養周期短，轉染效率高，批次產量高的優點；另有文獻表明，適當降低轉染后的細胞培養溫度至31℃，能提供更高的重組蛋白產量。該實驗方法可以滿足生產企業及科研機構在短期內大量生產重組蛋白的需求，并為實驗單位節省了勞動力開支及耗材成本。