摘要： 學習克隆工作中最常用的雙酶切,將外源基因與質粒連接方法及操作技術.
一、實驗目的：
1、學習克隆工作中最常用的雙酶切；
2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術；
3、學習氯化鈣法制備 大腸桿菌 感受態細胞的技術；
4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義.
5、外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術.
6、學習鑒定重組子的方法.
二、實驗原理：
重組子的建立：采用雙酶切 質粒 載體pBR322和pUC18,酶切后產生了互補的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個質粒片段連接.
感受態細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化學試劑法)的處理后, 細胞膜 的通透性發生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competent cell) .
轉化(transformation)：是將異源DNA分子引入一 細胞株 系,使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程等研究領域的基本實驗技術.
電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞.
克隆的篩選：主要用不同 抗生素 基因篩選.常用的 抗生素 有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等；
重組質粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有α-互補、小規模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法.
最常用的方法是小規模制備質粒DNA進行酶切分析,對于帶有LacZ基因的載體還可以結合α-互補現象來篩選.
三、試劑與器材：
1、試劑：pUC18質粒,pBR322質粒,DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液,DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),LB液體培養基(Luria-Bertani) ,LB固體培養基,50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液,質粒快速提取試劑盒(博大泰克),10 X Buffer K, Pst I,EcoR I (TaKaRa)
2、器材：電基因轉移議,恒溫搖床,臺式高速離心機,恒溫水浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫 培養箱 ,電泳儀,超凈工作臺, 微量移液槍,eppendorf管.
四、操作方法：
1、構建重組質粒
質粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產物按照1：1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構建成重組質粒.
2、制備感受態大腸桿菌細胞
收集大腸桿菌細胞,采用CaCl2處理,制備成 感受態細胞 .
3、重組子的轉化
將構建的重組質粒加入到制備的感受態細胞懸浮液中,電擊法將重組質粒轉化到宿主細胞中.
4、重組子的篩選鑒定
采用藍白篩選重組子.酚/氯仿快速抽提質粒,酶切后 電泳 鑒定.
五、關鍵步驟與注意事項：
1、連接反應溫度選擇要適中,過高粘末端之間形成氫鍵不穩定,過低會影響 連接酶 的活性.
2、連接反應兩種質粒的比例為1：1,否則容易自連.
3、制備感受態細胞時要采用對數生長期初期的細胞,低溫處理時間要足夠.
4、電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適.
5、轉化及藍白篩選要作陰、陽性對照,防止出現假陽性、假陰性.
六、思考題：
1、連接反應的溫度選擇的依據是什么？
2、試分析自己實驗得到的電泳結果？
3、怎樣保證DNA片段的高回收率和連接的高效率？
4、制備感受態細胞的原理是什么？
5、可將外源基因轉化受體細胞的方法有哪些？
6、通過什么手段可以降低質粒自身環化的數量？