材料、設備及試劑
一、 材料
外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。
二、 設備
恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。
三、 試劑
1、連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L
二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。
2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。
3、X-gal儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。
4、IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。
5、含X-gal和IPTG的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養基表面的液體完全被吸收。
操作步驟
一、 連接反應
1、取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號。
2、將0.1μg載體DNA轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。
3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時。
同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質粒載體。
二、 E. coli DH5α感受態細胞轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
2、 加入連接產物溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／涂板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／涂板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
三、 重組質粒的篩選
1、每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上,37℃下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。
2、倒置平板于37℃繼續培養12-16小時,待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。
3、放于4℃數小時,使顯色完全（此步LB培養基不做）。
不帶有T-vectorDNA的細胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養基上成活。帶有T-vector的空載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在X-gal和ITPG培養基上為藍色菌落；帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培養基上為白色菌落。
四、 酶切鑒定重組質粒
用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml
LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA直接電泳，同時以煮沸法抽提的T-vector做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較T-vector慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。
[注意] 1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。
2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。
3、連接反應后，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。
4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。
5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環化，增加外源DNA和載體連接的機會。
6、LB選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。
7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-
galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。
8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。