第一節 概 述
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆 較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆
,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接,
再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA
的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA 片段和載體DNA
的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆
策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。
外源DNA 片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：
1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆 的DNA
片段，一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA
片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。
2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。
由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA
均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA 的濃度,
以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA 的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質粒DNA
的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入E.
coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。
3、帶有平末端 是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA
聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA
濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA 分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。
特殊情況下，外源DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA
片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA
聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。
本實驗所使用的載體質粒DNA 為pBS,轉化受體菌為E. coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。
因pBS帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA 的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。
pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.
coli
DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和
DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+
細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變,
表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力,
因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA
分開。此為α-互補現象篩選。