重組DNA分子的轉化實驗原理和實驗步驟（一）

1實驗原理

DNA重組分子在體外構建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化。對于不同的受體細胞，往往采取不同的轉化戰略。

1.1 DNA重組分子的常用轉化方法

1.1.1 Ca 2 誘導轉化

1970年Mandel和Higa發現用CaCl2處理過的大腸桿菌能夠吸收l噬菌體DNA，此后不久，Cohen等人用此法實現了質粒DNA轉化大腸桿菌的感受態細胞，其整個操作程序為：1）將處于對數生長期的細菌置入0℃的CaCl2 低滲溶液中，使細胞膨脹，同時Ca2 使細胞膜磷脂層形成液晶結構，使得位于外膜與內膜間隙中的部分核酸酶離開所在區域，這就構成了大腸桿菌人工誘導的感受態；2）此時加入DNA，Ca 2 又與DNA結合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上；3）經短暫的42℃熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結構發生劇烈擾動，隨之出現許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內。此外在上述轉化過程中，Mg 2 的存在對DNA的穩定性起很大的作用，MgCl2 與CaCl2 又對大腸桿菌某些菌株感受態細胞的建立具有獨特的協同效應。1983年，Hanahan除了用CaCl2 和MgCl2 處理細胞外，還設計了一套用二甲基亞砜（DMSO）和二巰基蘇糖醇（DTT）進一步誘導細胞產生高頻感受態的程序，從而大大提高了大腸桿菌的轉化效率。目前，Ca 2 誘導法已成功地用于大腸桿菌、葡萄球菌以及其它一些革蘭氏陰性菌的轉化。

1.1.2 PEG介導的細菌原生質體轉化

在高滲培養基中生長至對數生長期的細菌，用含有適量溶菌酶的等滲緩沖液處理，剝除其細胞壁，形成原生質體，它喪失了一部分定位在膜上的DNase，有利于雙鏈環狀DNA分子的吸收。此時，再加入含有待轉化的DNA樣品和聚乙二醇的等滲溶液，均勻混合。通過離心除去聚乙二醇，將菌體涂布在特殊的固體培養基上，再生細胞壁，最終得到轉化細胞。這種方法不僅適用于芽孢桿菌和鏈霉菌等革蘭氏陽性細菌，也對酵母菌、霉菌甚至植物等真核細胞有效。只是不同種屬的生物細胞，其原生質體的制備與再生的方法不同。

1.1.3電穿孔驅動的完整細胞轉化

電穿孔（Electroporation）是一種電場介導的細胞膜可滲透化處理技術。受體細胞在電場脈沖的作用下，細胞壁上形成一些微孔通道，使得 DNA分子直接與裸露的細胞膜脂雙層結構接觸，并引發吸收過程。具體操作程序因轉化細胞的種屬而異。對于大腸桿菌來說，大約50ml的細菌與DNA樣品混合后，置于裝有電極的槽內，然后選用大約25微法拉第、2.5千伏和200歐姆的電場強度處理4.6毫秒，即可獲得理想的轉化效率。雖然電穿孔法轉化較大的重組質粒（＞100Kb）的轉化效率比小質粒（～3Kb）低一千倍，但這比Ca2 誘導和原生質體轉化方法理想，因為這兩種方法幾乎不能轉化大于100Kb的質粒DNA。對于幾乎所有的細菌均可找到一套與之匹配的電穿孔操作條件，因此電穿孔轉化方法有可能成為細菌轉化的標準程序。