試劑、試劑盒 DEAE Sephadex* A-50(干粉）濃 NaOH透析存留物緩沖液 B
儀器、耗材 超速離心機玻璃層析柱蠕動泵、紫外（UV) 檢測器、分部收集器和砌硅玻璃管
實驗步驟
材料和設備
DEAE Sephadex* A-50(干粉）（Pharmacia Biotech,Inc.)
濃 NaOH(10mol/L)
透析存留物，得自實驗 3
超速離心機
玻璃層析柱（直徑 5 cm)
層析裝置：蠕動泵、紫外（UV) 檢測器、分部收集器和砌硅玻璃管（16X150 mm)
試劑
緩沖液 B(10x（臨用前配制 4000 mlx 緩沖液 B，加 2-疏基乙醇至 1 mmol/L)(配方，見“試劑的配制”，PP.82—83)
操作程序
1) 用 1x 緩沖液 B 溶脹 DEAE Sephadex A-50 樹脂，4°C 過夜或沸水浴 1 小時 (h)。pH8.0 下，樹脂溶脹至約 30 ml/g(見文獻 Ion Exchange Chromatography)，故裝一根 400-ml 的柱子約需 15 g 干樹脂。
2) 用濃 NaOH 將樹脂懸漿的 pH 調至 8.0。樹脂是以酸性形式供應的，因此需用幾毫升 NaOH。不要用攪拌子攪拌，否則會把顆粒攪破。用移液管或玻璃棒手動攪拌。調好 PH 后, 靜置，讓樹脂沉下，去上清。按此法用 1X 緩沖液 B 洗滌三次，每次洗滌后重校 pH, 直至 pH 為 8.0 并保持不變。
注：DEAE-纖維素是以游離堿的形式提供的，因此，必須用濃酸如，12 ml/LHCl) 來調節它的 pH。
3) 小心地將透析存留物從透析袋中轉至燒杯。再轉至 30-ml 塑料離心管中。用高速離心機 4°C、20000r/min 離心 1h。
4) 將上清倒入燒杯中。4°C 下測定樣品的電導率，與 4°C 下 1X 緩沖液 B 的電導率進行比較。樣品的電導率必須等于或低于緩沖液的電導率。如果太髙，加蒸餾水至與緩沖液 B 相同。盡量保持小的體積（這就是為什么要用透析而不稀釋的原因記錄體積。留 1% 供分析用并記錄其體積。
5) 按圖 1-5 所示，裝填柱子，安裝層析裝置。如必要，更換底部的尼龍網。在柱床之上保留約 2 cm 的緩沖液，以利于梯度混合。讓洗脫液經 UV 檢測器流出，確保記錄儀上出現基線。調節分部收集器分部收集約 10~12-ml 的組分。
6) 將蠕動泵的進液口放人裝有樣品的燒杯中，加樣，密切注視進液口，使不要吸入空氣。用 1X 緩沖液 B 洗柱，直至記錄儀上的 UV 信號接近原來的基線。將流出液收集在一燒杯中。在梯度開始前不需要收集組分。
7) 梯度洗脫液的總體積為 1000 ml:500 ml1x 緩沖液 B 對 500 ml 含 0.7mol/LNaCl 的緩沖液 B。注意，lx 緩沖液 B 中已含有 0.2 ml/L 的鹽，為制備 0.7mol/L NaCl，可加人 14.62 g NaCl 于 500 ml 1x 緩沖液 B 中。用一同心圓塑料梯度混合器：高鹽置外腔，低鹽置內腔。攪拌子置內腔，適度攪拌。
8) 按 10~12-ml 組分將全部梯度洗脫液分部收集在硼硅玻璃試管中。用 DEAE 陰離子交換層析純化鈣調蛋白的典型結果見圖 1-6。
