一、 簡介
金屬螯合親和層析介質，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。因此，偶聯這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結合，但這種結合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結合力。
鎳NTA親和層析介質（Ni-NTA ）具有特異性好、流速快的優點，顆粒粒度均勻，粒徑小，并且螯合鎳更穩定，能耐受更高的還原劑，物理和化學穩定性好，批次重復性好。本產品已經螯合好鎳離子，使用更方便。
二、 性能參數：
特點 | 基團密度高，載量大，分辨率高，使用方便 |
基質 | 6%的交聯瓊脂糖凝膠 |
配體 | Ni2+ |
配體密度 | 20-40μmol /ml |
吸附載量 | 15mg蛋白/ml |
介質顆粒大小 | 45-165μm |
最大流速 | 15000px/h |
pH范圍 | 3-10，在位清洗時pH范圍可到2-11 |
保存溫度 | +4-8℃ |
保存液體 | 20%乙醇 |
三、 適用范圍
分離帶His標簽的重組蛋白及能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、 應用實例
實驗名稱：Ni-NTA 分離帶His標簽的重組蛋白
實驗步驟：
1、Ni-NTA 裝柱，1.6×500px，柱床體積為10ml；
2、用緩沖液1平衡2~5個床體積，流速為2ml/min；
3、將20ml細胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm濾膜過濾，上樣，流速為1ml/min；
4、用緩沖液1再洗2~5個床體積，流速為2ml/min；
5、用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度；
6、用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4-8℃環境中保存。
緩沖液組成：
緩沖液1：50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g, 加適量水溶解后定容到1000ml。
緩沖液2：50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加適量，水調pH后定容到1000ml。
緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B配制：
咪唑濃度 | 緩沖液1量(ml) | 緩沖液2量(ml) |
10 mM | 98 | 2 |
20 mM | 96 | 4 |
50 mM | 90 | 10 |
100 mM | 80 | 20 |
200 mM | 60 | 40 |
300mM | 40 | 60 |
400 mM | 20 | 80 |
SDS-PAGE流程：
1、BCA法測量樣品蛋白濃度
2、根據測定樣品的蛋白濃度，算出5~10μg/孔所需的體積。
3、向1.5ml EP管中加入含5~10μg蛋白的樣品溶液，若體積小于10μl，則加20mM PBS pH7.4補足10μl；若體積大于10μl，則要加入1ml無水乙醇，－20℃下濃縮1h。
4、取濃縮樣品10000rpm離心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除殘余的乙醇。
5、在樣品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10μl，100℃下10min。取出后冷卻30s，4000rpm離心1s。
6、點樣，電泳。
實驗結果：
（1）使用Ni-NTA Agarose純化His標簽重組蛋白
His標簽重組蛋白的上樣量為20ml，用分別含20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液B進行洗脫，色譜結果見圖1，色譜各組分的SDS-PAGE結果見圖2。
圖1. Ni-NTA Agarose純化帶His標簽重組蛋白色譜圖
圖2. SDS-PAGE 圖譜