1、 標準蛋白， 2、上樣液， 3、流穿液， 4：20mM洗脫液， 5：50mM洗脫液，
6：100mM洗脫液， 7：200mM洗脫液， 8：300mM洗脫液， 9：400mM洗脫液。
（2）使用Ni-NTA Agarose純化His標簽重組蛋白包涵體
條件和前面的方法基本相同，只是緩沖液中加了8M的脲，溶液配方如下表，其純化色譜圖和電泳圖分見圖3、圖4。
要注意的是不同的包涵體溶解度不同，也可以用6M鹽酸胍代替8M脲，因為鹽酸胍溶解包涵體更完全。
緩沖液組成：
緩沖液1：50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g 和脲480 g，加熱溶解后定容到1000ml。
緩沖液2：50mMpH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，
NaCl 29.3g，咪唑34g和脲480 g，加熱溶解后定容到1000ml。
緩沖液3：不同咪唑濃度的緩沖液B配制：
咪唑濃度 | 緩沖液1量(ml) | 緩沖液2量(ml) |
50 mM | 90 | 10 |
400 mM | 20 | 80 |
圖3. Ni-NTA Agarose純化His標簽重組蛋白包涵體色譜圖
圖4.SDS-PAGE圖
1：包涵體，2：流穿液，3：50mM咪唑洗脫液，4：400mM咪唑洗脫液。
（3）不同金屬離子及洗脫條件對純化效果的影響
使用Ni-NTA Agarose，His標簽重組蛋白的上樣量為10ml，用含有20、50、100、200、500mM咪唑的緩沖液3洗脫，緩沖液1和2均加入終濃度為1%的吐溫80，其結果表明加入表面活性劑可以降低雜吸附。此外分別螯合銅鈷金屬離子做同樣的純化實驗，結果表明在回收率和純度上都以螯合鎳離子的效果最好，其分離純化的純度可以＞90%，而目標蛋白的回收率高達80%，所以建議首選鎳離子螯合填料，別的可以不用考慮。
五、 應用注意事項：
鎳離子金屬螯合親和層析介質最經典的配體是IDA。鎳離子有六個螯合價數，Ni-IDA螯合了三價，剩余三價；而Ni-NTA螯合四價，剩余兩價，因此Ni-IDA瓊脂糖凝膠作用力要比Ni-NTA瓊脂糖凝膠的強。也正因為這個原因，在同樣條件下Ni-IDA洗雜質和目標蛋白的要比Ni-NTA的咪唑濃度高，但是NTA的填料更穩定，耐受更強的還原劑，更不容易脫落；而IDA的載量要比NTA高，可以反復利用，更加經濟。具體用哪個填料完全看個人的習慣以及純化的條件而決定。
六、有關操作說明
1、色譜柱裝填
（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。
（2）在柱下端加入蒸餾水，以除去柱中空氣，關閉柱出口，在柱內保留少量蒸餾水。
（3）將介質連續倒入柱子時，要用玻璃棒緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產生，讓介質自然沉降。
（4）柱壓不超過0.3MPa，如果裝柱系統中無法測柱壓，則控制流速高于7500px/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。
2、固定金屬離子
（1）金屬離子的固定必須用過濾好的金屬離子溶液，以防止金屬鹽在介質上沉淀。
（2）用2-5倍柱床體積的蒸餾水充分平衡柱子。
（3）選擇合適的金屬離子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，濃度為0.1~0.3M。如果是Fe3+必須在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+產生沉淀。
（4）用2-5個柱床體積的金屬離子溶液上柱，再用不少于5倍柱床體積的蒸餾水洗滌色譜柱，洗去未螯合的金屬離子。（當然也可以把洗凈沒有螯合的填料直接和需要的金屬離子溶液在搖床上震蕩過夜，這樣螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其適合用這樣的方法。）
（5）用2-5倍柱床體積的起始緩沖溶液平衡柱子，再上樣。
（6）如果是螯合鐵離子，要注意的是在中性條件下，Fe3+很容易被還原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pH最好是3-5。螯合Fe3+的色譜柱不能長時間保存在中性溶液中。建議每次用完后都要將螯合的Fe3+用50 mMEDTA溶液洗凈，下次使用時再重新螯合。如果洗不干凈，也可以將介質浸在50mM的EDTA中過夜后再清洗保存。
3、上樣
（1）樣品通溶解在pH5.5~8.5的緩沖液中，提高上樣緩沖液的pH值，可以增大載量。
（2）選擇起始緩沖液，主要是依據金屬離子的特性及樣品與金屬離子的結合特性。
（3）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，也最好不含巰基乙醇等還原劑。
（4）常用緩沖液有10~20m M磷酸鈉鹽緩沖液和50mM醋酸鈉緩沖液
（5）在緩沖液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除離子交換作用。
（6）使用金屬螯合層析有一個通常的法則，如果不了解蛋白的結合特性，建議先選用Zn2+，緩沖液可以選擇中性的磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液，NaCl的含量為0.15-0.5M，作為起始緩沖液。
（7）緩沖液中的去污劑一般不會影響對蛋白的吸附作用。
（8）蛋白被吸附時，經常會有一部分的螯合金屬離子被替換，這種現象通常是可見的，尤其是使用有色的金屬離子時，比如Cu2+，所以使用幾次后可以先把金屬離子洗下來，然后再重新螯合金屬離子。
4、洗脫
（1）線性降低或一步降低pH，大多數蛋白在pH6~4會被洗脫下來，也可以在pH3~4，緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸、磷酸鹽緩沖體系。
（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加與金屬離子有親和力的物質，如0~0.5M咪唑，0~50 mM組氨酸，0~2M NH4Cl。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH下進行。
（3）EDTA、EGTA等螯合劑會與金屬離子產生作用力，導致蛋白被洗脫下來，這種方法不能使不同的蛋白分離，此外會影響蛋白吸附，導致融合蛋白不能掛柱。
（4）所有上述情況中，緩沖液中必須加入0.15~0.5M的NaCl 以消除離子交換作用。
（5）當螯合離子配基是Cu2+時，有以下的三種操作方式：
降低pH：
上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4
洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 3.5
競爭洗脫：
上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 1M NaCl， pH 7.4
洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 1M NH4Cl， pH 7.4
脫落洗脫：
上樣緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， pH 7.4
洗脫緩沖液：50 mM Na2HPO4， 0.5M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4
使用降低pH和脫落洗脫都會使金屬離子掉下來，下次使用就得重新螯合金屬離子。
七、 再生、清洗、保存
1、凝膠的再生
（1）螯合一種新的金屬離子之前，必須將膠再生。用5~10倍體積的50mM EDTA淋洗柱子，再用2~3倍體積的0.5M NaCl洗掉殘留的EDTA。
（2）金屬離子的重新固定的方法如前文所述。在一些操作中，變性蛋白和脂質不能在柱子的再生過程中被洗脫下來，他們可以通過在位清洗被除去。
2、在位清洗
（1）除去因離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。
（2）除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M NaOH以2500px/h的速度淋洗柱子1h。
（3）所有操作中，都要用至少3倍柱床體積的初始緩沖液洗柱子。
（4）除去強的疏水性蛋白和脂質等，用4倍柱床體積的70%的乙醇或者30%的異丙醇洗柱子，再反向淋洗。
八、保存
在20%乙醇中，4℃下長期保存。