一、實驗目的
1．通過對DNA的酶切，學會設計構建體外重組DNA分子；
2．根據目的基因合理選擇載體與限制性內切酶；
3．掌握DNA的酶切技術。
二、實驗原理
限制性內切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別：…GAATTC… 切割后產生
…CTTAAG…
…G和AATTC…的末端，
…CTTAAG…
該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團。即…G-OH
…CTTAA-P。
有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別 GATC ；有的識別六
CTAG
堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內切酶由于識別順序在DNA出現的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I
…GCGGCCGC…
…CGCCGGCG… 則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現，因而切割后產生的片段變化范圍很大。
限制性內切酶作用的溫度一般為37℃，反應體系中以Mg2＋為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。
商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內完全酶解1μg DNA的酶量）。
三、實驗材料
待酶切的DNA樣品
四、實驗儀器、器皿及試劑
儀器：可調微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈
器皿：Eppendorf管、Tip、試管架
試劑：Hind III酶切標準DNA分子量
Hind III限制性內切酶
10×buffer：50mmol/lNaCl
10mmol/lTris-HCl(pH7.5)
10mmol/lMgCl2
lmmol/l DTT（二硫蘇糖醇）
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
五、實驗步驟
1．將DNA樣品lμg溶解在16μl重蒸水中（在滅菌的Eppendorf管中進行）
2．加入2μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。
3．加入1~2u的限制性內切酶Hind III（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質，吸完后盡快放回冰箱）。
4．混勻反應液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育1小時。
5．終止反應加入 0.5mol/l EDTA-Na2至終濃度為10mmol/l。
6．進行電泳檢查酶切結果，100V 0.5~1小時。
7．紫外燈下觀察消化效果。
六、注意事項
1．分子生物學實驗大多為微量操作，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性以保證酶切效果最佳。現介紹三種微量取樣方法：
(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導致吸樣不準。
(2)用1cm長的塑料毛細管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。
(3)目前也有細長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。
2．限制性內切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導致浪費。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內切酶浪費的因素就是限制性內切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內切酶拿出冰箱的時間盡可能短。
若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應管內。這樣可節約用酶且縮短操作過程、減少污染機會。
3．開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防雜酶污染。
4．樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。
5．無實驗必要應盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗結果。