限制性核酸內切酶分布極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發現至少一種限制性內切酶，多者在一屬中就有幾十種，例如在嗜血桿菌屬中（Haemophilus）現已發現的就有22種。有的菌株含酶量極低，很難分離定性；
然而在有的菌株中，酶含量極高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高產酶菌株。據報道從10g的H. aegyptius的細胞中，能分離提純出可消化l0gλ噬菌體DNA的酶量。細菌是限制性內切酶，尤其是特異性非常強的I類限制性內切酶的主要來源。
