該技術是利用限制性內切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產生限制性片段的特性，對于不同種群的生物個體而言，他們的DNA序列存在差別。如果這種差別剛好發生在內切酶的酶切位點，并使內切酶識別序列變成了不能識別序列或是這種差別使本來不是內切酶識別位點的DNA序列變成了內切酶識別位點。
這樣就導致了用限制性內切酶酶切該DNA序列時，就會少一個或多一個酶切位點，結果產生少一個或多一個的酶切片段。這樣就形成了用同一種限制性內切酶切割不同物種DNA序列時，產生不同長度大小、不同數量的限制性酶切片段。后將這些片段電泳、轉膜、變性，與標記過的探針進行雜交，洗膜，即可分析其多態性結果。