雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，為防止兒童性早熟等問題，食品中尤其是畜禽產品的雌二醇檢測不容忽視。膠體金免疫層析技術(GICA)在檢測小分子有機物方面越來越受到重視。其基本原理是膠體金顆粒能夠穩定吸附蛋白質，而蛋白質的生物活性無明顯變化，所以它可以取代酶標記抗體〔1，2〕。本實驗采用標記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結合物相結合，固定有雌二醇結合物的檢測線處就顯現明顯的顏色〔3，4〕。本法具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本較低、結果容易判讀等優點，適用于樣品的初步篩選。
一、材料與方法
1、試劑與儀器 氯金酸(上海化學試劑廠)；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津聯星生物公司)；雌二醇標準品、雌二醇單抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美國Sigma公司)；其他試劑均為國產分析純。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜（美國Millipore公司)；Beckman Du530分光光度計(德國Beckman公司)；低溫高速離心機(軍事醫學科學院）；點膜機(美國Bio-Dot公司)。
2、方法
（1）膠體金的制備 用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g／L.先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100ml加入1％檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min〔5〕，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度。最后置于4℃冰箱保存備用。
（2）最適標記蛋白量的確定 用02mol／L K2CO3將膠體金溶液調至pH為82，然后取試管9支，分別加入10ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設一不加抗體的對照管。放置10min，在各管中加入01ml的10％NaCl，混勻后靜置2h.觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍，而加入蛋白量達到或超過時的溶液則保持不變。標記蛋白量即為最低穩定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎上再加20％。
（3）膠體金探針的標記 將抗體用0005mol NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調至05mg／ml.取膠體金100ml，用0，2mol／L K2CO3將膠體金溶液調至pH為90，磁力快速攪拌下緩慢加入24ml稀釋的雌二醇抗體，繼續攪拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最終濃度為1％，再攪拌10min.將初步制得的膠體金探針以4000r／mm離心20min；棄沉淀，上清以10000r／min離心60min；棄上清，沉淀用001mol／L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1％牛血清白蛋白)重新懸浮；同前離心洗滌2次，將沉淀用001mol／L的PBS(pH82，含1％BSA，002％NaN3)懸浮，4℃保存備用。
（4）抗原的合成 小分子物質難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質才能較好地固定。本實驗采用混合酸酐法制備完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50μl,二氧六環4ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15μl〔6〕。4～10℃下反應30min.配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10mg，3ml水，3ml二氧六環，1mol／L氫氧化鈉03ml)。將配制好的OVA溶液加入反應液，4℃冰浴攪拌6h，反應過程中，用氫氧化鈉維持pH值為8.反應完畢后，將反應液加入透析袋，透析2d.將透析液調至pH45，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將OVA溶于透析液內作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-OVA進行定性檢驗。經紫外測定證明蛋白質已與雌二醇衍生物結合。
（5）膠體金免疫層析試紙條制備 測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細條，然后放入含1％BSA、1％Tween-20的PB液中浸泡30min，37℃烘干，最后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點膜機將上述抗原和兔抗鼠IgG噴成2條線，分別為檢測線和對照線，經真空干燥后，用1％BSA、001mol／L PBS（pH90)封閉2h，以001mol／L PBS洗滌，再真空干燥。將30mm吸水紙、25mm硝酸纖維膜、6mm玻璃纖維膜、15mm加樣紙，由頂部依次粘于PVC板上，裁成細條備用。
（6）檢測與判讀 樣品：含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為02μg／ml雌二醇，第3組為04μg／ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5min，觀察結果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現2條紫紅色帶為陰性；如質控線不出現紫紅色帶，無論檢測線是否出現，測試結果均無效。
二、結果與分析
1、膠體金顆粒大小選擇 膠體金顆粒吸附蛋白并顯示檢測結果，其大小是重要影響因素之一。膠體金顆粒的大小，由制備膠體金時加入的檸檬酸三鈉量決定，當檸檬酸三鈉加入越多，膠體金顆粒也越多，但顆粒直徑越小，反之膠體金顆粒越大。膠體金顆粒小，結合蛋白量少，反應結合率低，另外難以顯示明亮清晰的顏色，影響顯色效果；膠體金顆粒大，其結合蛋白后不穩定，不易保存，另外其結合蛋白后難以通過膜〔7〕。本實驗選用的膠體金顆粒直徑約為15min，既可以通過膜，反應徹底，又易保存，反應結果顯色清晰。
2、膠體金顆粒鑒定 膠體金顆粒大小及均一程度是檢測結果可靠的基礎，制備完畢后須經質量鑒定才能應用。用Beckman Du530分光光度計對膠體金進行掃描，發現其主峰寬度較小，表明制備的膠體金顆粒較均勻，λmax為520nm(圖1)，表明其粒度約為15nm〔8〕。用電鏡觀測結果(圖2)與分光光度計測定結果一致。電鏡觀測是鑒定膠體金顆粒粒徑及分布的標準，但這種方法不便用于日常工作使用，而用分光光度計測定操作簡便，更適合實驗室日常使用。
圖1 膠體金的可見光譜圖（略）
3、最適蛋白量 陰性對照為未加抗體管，1～7管抗體濃度分別為10,12,14,16,18,20,22μg／ml,陽性對照為膠體金溶液。可見，本實驗最適標記蛋白量為20μg／ml(圖3)。
4、E2-OVA濃度 用PBS(pH74)溶解E2-OVA濃度為005～10mg／ml,噴在硝酸纖維膜上作檢測線，發現E2-OVA濃度越高，檢測液中也需要越高濃度的E2與之競爭，檢測靈敏度也就越低。但是，E2-OVA濃度低于05mg／ml，檢測線顏色太弱，難用肉眼分辨。
圖2 膠體金電鏡圖（略）
陰性對照為未加抗體管；陽性對照為膠體金溶液
圖3 膠體金與雌二醇抗體結合濃度確定實驗（略）
5、檢測限 本實驗的檢測限是以完全看不見檢測線為最低檢測限〔9〕。將雌二醇標準品用甲醇配制成04，02，01，005μg／ml 4個標準溶液，用上述檢測方法進行檢測(圖4)。由圖可見，最低檢測線為100ng/ml.
圖4 試紙條檢測樣品（略）
6、對比實驗 取30份樣品，檢測分為3組，第1組不加雌二醇，第2組加02μg／ml雌二醇，第3組加04μg／ml雌二醇，分別用GICA法與氣質聯用法(GC／MS)檢測。實驗結果顯示，第1組2種方法均未檢出；第2組GICA法陽性9粒，陰性1粒，GC／MS法陽性10粒；第3組2種方ň觳庋糶浴Ｓ紗絲杉氡曜技觳夥椒ㄏ啾齲珿ICA法準確度為9667％。
27 交叉反應試驗 實驗結果顯示，與己烯雌酚、炔雌酚、壬基酚、阿特拉津及雙酚A等環境內分泌干擾物中的環境雌激素無交叉反應，表明該方法具有良好的特異性。
三、小結
目前，關于雌二醇的檢測有氣、液相色譜和光譜、質譜等方法，但其儀器昂貴、操作復雜、檢測時間較長。本文建立的免疫膠體金層析法具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本較低、結果容易判讀等優點，且無需任何儀器，操作簡單，適用于樣品的初步篩選。
四、參考文獻
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