非標記抗體免疫電鏡實驗技術

實驗概要

本文介紹了非標記抗體免疫電鏡實驗技術的具體操作方法。

實驗原理

標記抗體法雖然具有許多優點，但也存在一些難以克服的問題，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱；化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響；結合物中未標記的抗體可與抗原競爭結合，影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統的非標記抗體的免疫學反應，對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab′)2，一個Fab片段與標本中的抗原結合，一個Fab是抗體蛋白的結合片段。在抗體與標本作用后，再加入鐵蛋白與抗體結合，從而顯示組織內抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負染后，直接電鏡觀察。

主要試劑

1. 已知抗體
2. 磷鎢酸
3. 瓊脂糖

主要設備

1. 高速離心機

2. 透射電鏡

3. 400目銅網Fomnvar膜

4. 直徑4mm玻璃珠

實驗材料

待檢病毒材料如糞便、氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養液等。

實驗步驟

1. 經典法

   1) 將被檢病毒材料0.9ml，加1:5～1:10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。

   2) 置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。

   3) 以17 000r/min～23 000r/min離心90min。

   4) 吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體。

   5) 沉淀物中加少量H₂O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec～30Sec，滴加于400目銅網Fomnvar膜上，用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多余的負染液。

   6) 在透射電鏡下4×10⁴倍觀察。

2. 快速法(瓊脂擴散法)
   1) 同經典法(1)、(2)步驟，制備免疫復合物。
   2) 以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml，冷卻凝固后，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。
   3) 將普通濾紙剪成2×3cm大小，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊，每塊帶有一個凹孔，平放在濾紙上。
   4) 在凹孔內，加入制備好的含病毒的免疫復合物懸液。
   5) 將電鏡載網的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用，20min～30min后，可將液滴的水分吸干，而濃縮的免疫復合物則粘附在載網膜上。
   6) 在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec，過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。
   7) 于透射電鏡4×10⁴倍下觀察。