非標記抗體免疫酶組織化學實驗——雙PAP法

在 PAP 法的基礎上重復第二抗體和 PAP 復合物，重復的連接抗體和 PAP 復合物可能有以下兩種連接方式（圖 4-10）。第一種（A）重復連接抗體可與一個 PAP 中的抗 HRP 抗體上未飽和的 Fc 段結合，再與后加的 PAP 復合物相結合；第二種（B）重復連接抗體與特異性一抗分子上未飽和的 Fc 段相結合，第一抗體上結合了更多的橋抗體和 PAP 復合物。正是這兩種連接方式，對抗原有了進一步放大作用，因而提高了 PAP 法的敏感性。但該方法也存在以下缺點：步驟多、費時、非特異性背景加重，因洗滌多而使脫片率提高。

石蠟切片動物血清

蛋白酶特異性一抗橋抗體PAP 復合物PBSDABH2O2BAB

滴管玻片

1. 4 μm 石蠟切片 58℃ 烤片 4 h，切片常規脫蠟至水。

2. 蛋白酶消化或 AR（組織抗原的暴露或抗原的修復，此步視情況而定）。

3. 0.3％ H₂O₂ 處理切片 20 min（室溫），PBS 洗 3 min × 2 次。

4. 3％ 正常動物血清處理切片 30 min（室溫），吸去多余血清，不洗。

5. 適當稀釋的特異性一抗孵育（4℃ 過夜或 37℃60 min），PBS 洗 3 min × 3 次。

6. 滴加橋抗體（二抗），37℃ 孵育 40 min，PBS 洗 3 min × 3 次。

7. 適當稀釋的 PAP 復合物（要求與特異性一抗同一種屬）37℃ 孵育 40 min。

8. PBS 洗 3 min×3 次。

9. 重復步驟 6～8。

10. 常規 BAB-H₂O₂ 顯色。

11. 水洗、復染、脫水、封片。

1. 假陰性及其處理

應用 PAP 法顯示抗原含量較多的組織或冰凍切片抗原保存良好的標本時，可導致陰性結果。Bigbee（1977）的研究證實，陰性結果是由于第一抗體用董過高，與組織抗原結合過多，使相鄰兩個抗體的 Fc 段間的距離恰好是連接抗體的兩個 Fab 段結合的長度，于是連接抗體不存在游離 Fab 段，僅存無活性的 Fc 段，所以不能將 PAP 復合物連接在與組織抗原結合的第一抗體上，導致陰性結果。尤其是冰凍切，而石蠟切片很少發生這種現象。克服的辦法是將第一抗體盡量稀釋。

2. 橋抗體

也稱連接抗體。它的兩個 Fab 段具有相同的結構、性質及與抗原結合的能力，因此，當第一抗體和 PAP 復合中抗 HRP 抗體來自同一種屬動物時，橋抗體能同時與上述二種抗體結合，起到橋的作用。為丁確保橋抗體的二個 Fab 段之一與第一抗體結合，另一個與抗 HRP 抗體結合，橋抗體的濃度必須高于常規用的第二抗體。

3.PAP 復合物

在 PAP 法和酶橋法中，特別強調第一抗體和抗 HRP 必須來自同一種屬，橋抗體才能發揮橋的作用，將其連接在一起。