非洲爪蟾涂片的制備
| 實驗材料 | 雌性非洲爪蟾 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | OR2 培養液 “5:1” 分離液 分散劑 |
| 儀器、耗材 | 培養皿 |
| 實驗步驟 | 1. 從麻醉了的雌性非洲爪蟾中取一塊卵巢，放在盛有溫度為 18~22℃ 的 OR2 培養液的培養皿（60 mm x 15 mm ) 中。 OR2 培養液： 82.5 mmol/L NaCl 2.5 mmol/L KCI 1.0 mmol/L CaCl2 1.0 mmol/L MgCl2 1.0 mmol/L Na2HPO4 5.0 mmol/L HEPES 2. 用珠寶鑷子分離單個卵母細胞或一小堆卵母細胞并轉移到一個新鮮的 OR2 培養皿中。在 18~22℃（不是在4℃）放 18~24 小時。這段時間結束的時候，幾乎所有卵母細胞，其至最大的卵母細胞都有轉錄活躍的含有大量燈刷染色體環的染色體。前面所推薦的使用促性腺素對雌性非洲爪蟾進行預處理并不是必需的。 3. 選一個直徑 1.0~1.1 mm 的卵母細胞放在盛有“5:1”分離液的小培養皿 （35 mm x 15 mm) 中。用兩把珠寶鑷子，在動物半球（黑色半球）上撕一個大口子，從伸出的細胞質中找到生發泡并把它弄下來。 “5:1” 分離液，pH 7.0 83.0 mmol/L NaCl 17.0 mmol/L KCl 6.5 mmol/L Na2HPO4 3.5 mmol/L KH2PO4 1.0 mmol/L MgCl2 1.0 mmol/L DTT 4. 20 秒內把完整的生發泡轉移到一個盛分散劑的培養皿中。 分散劑： 20.7 mmol/L NaCl 4.3 mmol/L KCl 1.6 mmol/L Na2HPO4 0.9 mmol/L KH2PO4 1.0 mmol/L MgCl2 0. 01 mmol/L CaCl2 1.0 mmol/L DTT 0.1% 低聚甲醛 5. 快速操作，用珠寶鑷子去掉核膜并把仍然完整的細胞核內含物轉移到已放滿分散劑的顯微鏡載玻片涂布小室中，加上蓋玻片并用凡士林封上。細胞膜內含物會在幾分鐘內分散，沉在小室的底部。 6. 玻片在 5~10℃ 以大約 5000 g 離心 30 分鐘。 7. 離心后，玻片垂直放到盛有 PBS + 2% 甲醛的染色培養皿中。平推蓋玻片，然后放在那兒1~2 小時別動。 8. 到這一步，如果核內含物牢牢貼在玻片上，就用刀片去掉涂布小室。 |
