非洲粟酒裂殖酵母的LiAc轉化法
非洲粟酒裂殖酵母的電穿孔轉化法
| 實驗材料 | 細胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 腺嘌呤 亮氨酸 LiAc |
| 儀器、耗材 | YEA 平板 |
| 實驗步驟 | 1. 在 YEA 平板上培養細胞直到長成可見單菌落。 2. 接種單菌落到添加有 150 mg/L 腺嘌呤、亮氨酸和/或尿嘧啶等營養缺陷互補物的 YEA 或 PM 培養基中，于允許溫度以 200 r/min 振蕩培養防止酵母菌沉積，使細胞滴度達到每毫升 5X106 到 1X107 個細胞。 3. 1000~2000 g 離心 5 分鐘，用滅菌蒸餾水洗一遍。 4. 用過濾除菌的 0.1 mol/L CH3COOLi，pH 4.9 洗一遍。 5. 重懸于 0.1 mol/L 的 LiAc 使細胞滴度為每毫升 109 個細胞，取 100 μl 等份轉移到微量離心管中，在允許溫度孵育 60 分鐘。 6. 加 1 μg 溶于 15 μl TE 中的質粒 DNA，輕輕旋轉混勻，于允許溫度孵育 60 分鐘。 7. 加 290 μl 預熱到允許溫度的 50% PEG3350，輕輕旋轉混勻。于允許溫度孵育 60 分鐘。 8. 于 42℃ 熱休克 15 分鐘，允許溫度下使細胞恢復 10 分鐘。9000 r/min 離心 2 分鐘沉淀細胞。 9. 用 1 ml 非選擇性基本培養基重懸細胞，轉移到 10 ml 非選擇性基本培養基中。于允許溫度孵育 30 分鐘，劇烈振蕩以保持細胞的懸浮狀態。然后置于室溫不搖孵育 30~90 分鐘。 10. 2000~4000 g 離心 10 分鐘沉淀細胞，重懸于合適體積的選擇性基本培養基中涂板，平板為 PM。 |
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