隨著非洲豬瘟（ASF）的來襲，國內熒光定量PCR實驗室如雨后春筍般地快速發展。熒光定量PCR方法已成為ASF防控過程中最常見的手段。我們通過調查發現：隨著檢測量的增加，各實驗室的環境污染問題日益突出。2019年初，仇華吉研究員多次在國內ASF防控會議上，從專家的角度呼吁大家在做ASF檢測和監測時，務必要防止實驗室本身所造成的污染問題。
自此，如何建立實驗室，如何防止實驗室的污染問題也逐漸引起了大家的關注和重視！我們通過與諸多實驗室共同地努力和不斷地優化，逐步建立了一套熒光定量PCR實驗室的環境污染監控和處理方法，分享給同行，供大家參考。
關鍵詞：PCR實驗室 環境污染 監控系統
SOP熒光定量PCR技術在國內獸醫體系的大量應用，多半是為了防控非洲豬瘟（ASF）。所以很多實驗室都是為了應對ASF疫情而倉促上馬的，設計不合理、運行不規范，經常會出現實驗室污染問題；而這些問題往往未能得到足夠的重視，導致出現“陰性對照不成立、甚至出現假陽性”的錯誤結果。為有效地控制PCR實驗室污染，我們通過對實驗室的設計和布局、實驗室環境污染監控體系的建立以及相關問題的處置、人員的培訓等方面來提高PCR實驗室檢測水平。
1.實驗室的設計和布局
1.1 關于PCR實驗室的設計和布局
PCR實驗室設計的科學與合理是保證實驗結果準確的必備條件。我們常見一些實驗室由于在設計上的缺陷，導致實驗室的環境污染難以去除，甚至不能再進行PCR檢測或不愿意使用高敏感的試劑盒來檢測（“鴕鳥策略”）！
標準化的 PCR 實驗室設計最主要考慮的兩個方面：
1、各區獨立
2、注意風向
PCR實驗室的分區我們按照污染程度來劃分：可分為試劑準備區-核酸提取區- PCR擴增區，普通的PCR實驗室還有產物分析區，其污染程度依次增大。PCR實驗室各個相對獨立的區域內要做好正負壓的控制，簡易的實驗室可以安裝不同數量的排風扇來實現不同區域的壓差。嚴格分區還要注意實驗室內的空氣在不同區域的流向問題。我們要防止擴增產物順空氣氣流進入上游擴增前的 “潔凈” 區域。所以，實驗室科學的通風設計在去除氣溶膠污染方面是非常有幫助的！
1.2 PCR實驗室的設計中常見的一些錯誤
我們參觀和了解過許多實驗室，發現有些PCR實驗室的設計存在嚴重的問題。下面是一些常見的設計錯誤，希望能夠引起大家的注意。
（1）中央空調互通：這樣就造成實驗室各區域的互通，非常容易造成整個實驗室的污染，進而不能使用。所以，需要在各區域另行安裝分體式空調或者安裝PCR實驗室專用的分區通風系統。
（2）隔斷不密封：有些實驗室在分區設計時，只是考慮實驗室在形式上的分區（各區分割不完全，有相通之處；各區之間無緩沖間；或者即便有緩沖間，卻在裝修時采用家庭裝修模式——吊軌式推拉門或者平開門，門的下面留有縫隙等等）。
（3）傳遞窗不密封：如果傳遞窗不密封，雖然有時方便了試劑、物品在不同實驗區間的傳遞，但同時也增加了交叉污染的風險。一個合格的傳遞窗應是雙開門且密封嚴實，并且兩邊的門最好設置連鎖裝置控制（即一次只能開啟一扇門）。此外，傳遞窗內應配有紫外燈照射裝置，并在每次使用后立即進行照射。
2.實驗室環境污染的監控體系建立以及相關問題的處置方法
2.1 PCR實驗室環境污染監控的重點
PCR實驗室環境污染監控和豬場環境監控的關注點是不一樣的。在實驗室層面，主要是關注產物和氣溶膠的核酸污染問題；而在豬場，則關注對病毒污染的監測。所以，我們對于PCR實驗室的監測關注點在重點區域和關鍵儀器設備方面。
下面是對PCR實驗室劃分的監測重點區域和關鍵的儀器耗材：
實驗區域：按區域采樣：試劑準備區、核酸提取區、 PCR 擴增區。采樣重點是在操作臺面和控制按鈕、冰箱門把手、離心機、槍頭盒蓋等。
儀器耗材：移液槍、離心機、渦旋振蕩器、核酸提取儀、PCR儀等。
2.2 PCR實驗室的環境采樣
實驗室環境采樣需要使用專用拭子（一般長度在10-15cm，易折斷為佳）。使用時將它浸入裝有350-500微升PCR級水的1.5ml離心管中，然后將拭子在離心管壁上適度擠壓，去除多余的水。注意：在不同區域采樣時需更換拭子。
（1）將拭子在長約30cm的取樣區域旋轉擦拭2-3次（臺面或離心機內表面）。然后將拭子放回離心管，渦旋震蕩10-15秒，洗脫拭子上捕獲的核酸。
（2）按上述方法去除拭子上的水，剩下液體作為檢測樣品。具體采樣檢測操作如下圖所示：
2.3 PCR實驗室氣溶膠污染的監控
氣溶膠污染的監控主要針對超凈工作臺和生物安全柜：可以采用空氣采樣方式。
（1）將6-8層紗布，其面積為30cm*30cm，用PCR級水或無核酸殘留的純凈水浸潤，打開風機，將其放在出風口5-10分鐘后取出。將紗布放在帶蓋的塑料離心管內，渦旋振蕩10-15秒，洗脫紗布上捕獲的核酸。
（2）或者，將裝有30-50微升PCR級水的1.5ml離心管，敞開蓋放置在不同的監測區域12-24小時采樣，然后進行檢測。
2.4 PCR實驗室環境監控頻率
我們可以根據實驗室不同的等級劃分和檢測樣本的情況，建議采取如下三種頻率進行：
（1）一般實驗室監控頻率可以按照: 每周或每兩周監測1次進行。【基層實驗室】
（2）檢測樣本非常頻繁，需要增加監控頻率：每周監控1-2次。【集團中心實驗室】
（3）國家參考實驗室：要求每天必須進行實驗室環境監控。【專業參考實驗室】
2.5 PCR實驗室環境監控配套試劑
PCR實驗室環境污染的監控需要配備專門的配套檢測試劑。IDEXX可以提供各PCR實驗室環境監測所需要的相關產品，幫助大家更專業地評估和及時發現實驗室可能存在的污染問題。
（1）IDEXX RealPCR? ASFV DNA Mix
（2）IDEXX RealPCR? PC DNA Tracker（陽性對照追蹤DNA檢測混合液）
（3）IDEXX RealPCR? Signal Check（QC細菌DNA檢測混合液）
實驗室環境監控方案
* 根據具體實驗室檢測內容來確定（ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……）
實驗室環境監控結果解讀
* 根據具體實驗室檢測內容來確定（ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……）
2.6 PCR實驗室環境污染處理措施
【方法一】將84消毒液配置成最終有效氯濃度為2000 mg/L的溶液，對重點污染區進行擦拭；孵育5分鐘后，用潔凈的紙巾擦拭干凈，再用清水或75%酒精進行兩遍清洗。
【方法二】使用商品化核酸清除試劑（如DNAZap、DNAOff或DNAAway）進行處理。使用時直接將商品化試劑噴涂于需要處理的區域，孵育5分鐘后用潔凈紙巾擦拭干凈后，再用清水或75%酒精進行兩遍清洗。同時建議配合房間的紫外燈和移動紫外燈（照射高度30-50 cm）對重點污染區、離心機、PCR儀等進行照射。建議消毒完后再進行各房間的通風。
2.7 PCR實驗室高風險污染區域的處理方法移液槍：
單按鈕移液槍：緩慢勻速移液。各區的移液槍要單獨使用且應有各自的標識；使用后，移液槍錐嘴處及表面用75%酒精溶液清潔。若使用過程中發生污染，應及時對移液槍咀使用75%酒精浸泡15分鐘左右。可考慮使用Eppendorf R-II移液槍（防止氣溶膠污染）。
離心機：每次實驗開始前，用75%的酒精擦拭離心機（外表、轉子及內壁）。每次實驗完畢后，先用84消毒液浸泡過的軟布擦洗離心機，再用潔凈的濕布擦洗，待干后蓋上機蓋。每月使用中性去污劑清潔轉子與離心室（打開離心機蓋，撥掉電源線，用專用設備將離心機轉子旋下）。
qPCR儀器：定期清潔熱蓋和反應槽。具體方法：關機后，將反應槽取出，打開熱蓋，用95%酒精或異丙醇浸透的棉棒擦拭反應孔（逐孔擦拭，污染嚴重時需逐孔更換擦拭所用的棉棒）和熱蓋，待酒精或異丙醇揮發后再將反應槽安裝好，將熱蓋恢復原位。若發生污染嚴重時則改用中性消毒液，按上述步驟消毒，然后再用95%酒精或異丙醇擦拭。
注意：實驗室環境監控出現污染并處理后，仍需要對處理后的效果進行二次評估，確定沒有污染后才可以進行實驗。
3.實驗室人員的培訓
PCR實驗室人員必需具有專業的素養，必需對實驗室檢測、監測方面非常清晰和了解，定期進行回顧和培訓。建立標準的SOP以及實驗室各種規章、制度等。
4.實驗室規范化操作流程（趙俊娜）
建立PCR實驗室規范化操作流程（SOP）非常重要！我們只有建立了良好的PCR實驗操作規范，才能有效降低實驗室環境的污染的發生，使我們的檢測結果更為準確！
4.1 實驗前：準備工作
（1）進不同區域要換不同的拖鞋、穿不同的工作服，戴上手套、口罩等。
（2）每日檢測前開啟紫外燈和移動紫外燈：距離臺面30-50cm照射30-60分鐘。
（3）開啟排風柜，保證檢測區域空氣單向流動。
（4）試劑、耗材的準備：特別是在裝槍頭的時候必需戴一雙全新的手套。
（5）標記好樣本。
4.2 實驗中：減少試劑、器具被污染的風險
（1）樣品的處理：按照規程處理樣本；試劑在前，樣本在后。
（2）最好使用帶濾芯的槍頭（防止氣溶膠的污染）。
（3）開管蓋時需防止液體接觸到手套；操作全程注意防止液體的飛濺和灑出。
（4）加樣順序：陰性對照、待檢樣本、陽性對照（不建議使用高濃度核酸或質粒作為陽性對照）。
（5）保存數據，清理廢棄物。
4.3 實驗后：及時清理，保證環境潔凈
（1）將吸頭、離心管、PCR產物等用消毒液浸泡處理。手套、口罩、鞋套丟棄于指定垃圾桶。若條件允許，則將廢棄物與樣品一同焚燒處理；或者與第三方合作處理。
（2）用84消毒液（按照有效氯2000mg/L濃度，現配現用）擦拭移液槍、儀器（注意PCR儀等屬于精密儀器，不建議使用84消毒液）、臺面等，作用后再用清水擦拭干凈，紫外燈照射。
依次清潔各區的實驗臺面和地面。各區清潔消毒工具均為專用。注意按照單一方向流程的原則進行清潔。
結論
非瘟防控，實驗擔當！在非豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測過程中，實驗室的檢測、監測起到了非常重要的作用！我們通過PCR實驗室科學的設計和布局、關注通風和風向、定期進行環境污染的監控和處置，能大幅度降低PCR實驗室的污染，增加檢測結果的準確性，從而為實驗室人員樹立信心。同時，注意實驗室操作人員專業化的培訓以及PCR實驗室人員規范化的操作，對于獲取準確的實驗室結果也非常重要！