鞣酸化紅細胞試驗中紅細胞的處理方法

1．新鮮紅血球新鮮紅血球用阿氏液保存于4℃，可供3周內使用。采用新鮮紅血球做凝集反應，模型新鮮，典型，而且敏感性也比醛化紅血球高出1～2個滴度。但用新鮮紅血球致敏后，保存時間短，而且不同動物個體和不同批次來源的紅血球均有差異，影響試驗結果和分析。為了克服這一缺點，多采用醛化紅血球或鞣化紅血球。

2．紅血球醛化極其優點

（1）醛化方法：常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化過程：①將紅血球用pH7.2PBS反復洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質；②按1︰8的比例取紅血球（壓積）和3%甲醛液（用pH7.2PBS稀釋，預先冷卻至4℃），緩慢混合，加膠塞4℃作用24h，不時搖動；③傾去上清液，再以1︰2（V/V）加入36%～38%冷的（10℃）甲醛溶液，混勻，再放入4℃24h；④⑷離心去上清，以生理鹽水反復洗滌4次。徹底清除甲醛液，最后以生理鹽水配成10%懸液甲醛化紅血球，加1/萬硫柳汞防腐，4℃保存。

戊二醛醛化過程：①取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1%戊二醛溶液，4℃保存備用；③將100ml 1%冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml紅血球中，邊加邊攪拌（也可置電磁攪拌器上）30min；④離心去上清，以生理鹽水洗滌4次，最后以PBS液（或生理鹽水）配成10%懸液，加1/萬硫柳汞，4℃保存。

丙酮醛—甲醛雙醛化過程：①取新鮮紅血球，洗滌4次，配成8%的懸液；②于紅血球懸液中加等量的3%丙酮醛室溫電磁攪拌16h～18h；③洗滌5次，再配成8%的懸液；④于紅血球懸液中加等量的3%甲醛，電磁攪拌16h～18h；⑤洗滌5次，最后以pH 7.2 PBS配成10%的懸液，加1/萬硫柳汞防腐，4℃保存。

（3）醛化紅血球的優點：①性質穩定，不影響紅血球表面的吸附能力；②重復性好，易標準化。③可較長期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如凍干保存，有效期則更長。

（4）影響醛化的因素：①紅血球的潔凈程度：由于紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質，易引起自家凝集，所以一定要充分洗凈；②紅血球的濃度：醛化時應盡量使紅血球稀釋度低一些，以減少紅血球的凝集和變形；③醛化時的溫度與醛化紅血球的質量有很大關系，一般認為最好是37℃。但有人認為應于4℃進行醛化；④醛化劑的濃度和醛化次數：醛化劑的濃度過大，易引起紅血球皺褶，濃度過低，又會增加溶血機會，所以一般以3%醛化濃度為宜。家禽紅血球一般醛化1～2次即可，而哺乳動物紅血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存時間也長。不同的雙醛化，其抗原致敏作用有所不同。

表各種雙醛化紅細胞的結果比較

脈沖/min是I標記的特異性抗體結合到細胞上的指標，脈沖數越大，結合抗體量也越多。但是從表5－1中可以看出結合量同可測出的抗原滴度是不平行的。

適當的振蕩可使醛化劑與紅血球充分接觸，并可排除凝塊形成。但過分地振蕩，則易產生氣泡，引起紅血球變形。

3．紅血球鞣化多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易于吸附紅血球表面，所以一般醛化處理即可。但對于許多蛋白質抗原，由于不易吸附于紅血球表面，所以在醛化的基礎上，必須再以一定濃度的鞣酸進行處理，強化它對蛋白質的吸附能力。

有人認為雙醛化后可不必進行鞣化。首都醫院做了“丙酮醛+甲醛+鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數意見認為醛化后仍需鞣化比較好。

(1)鞣化過程：①將10%醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次，最后以PBS配成2.50%懸液；②稱取優質鞣酸20mg，以生理鹽水4ml配成1﹕200的濃度，于37℃水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀釋成1﹕2 000的濃度。當天配制、當天用完；③1份2.5%紅血球懸液與1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r/min離心，去上清，用PBS液洗滌1次；④以0.02%牛血清白蛋白PBS液洗滌1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5%鞣化紅血球。

（2）影響鞣化的因素：①鞣酸的質量：這是很重要的，所以必須采用優質鞣酸。分析純的鞣酸呈面包屑狀，不呈面粉狀，有折光性；②鞣酸的濃度：濃度過高，可以出現紅血球的凝集現象；濃度過低，達不到紅血球的活化作用。醛化過的紅血球所采用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以1：2 000為佳；③鞣化時間：鞣化過程一般10min～15min即可完成。時間再長也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化時采用的pH對吸附抗原和血凝滴度影響不大，一般采用pH7.2的PBS液。