食品中蛋白質含量怎么測

7種蛋白質含量的測定方法

一、直接測定UV法

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

二、紫外吸收法

大多數蛋白質分子結構中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質在280nm的紫外光區產生最大吸收，并且這一波長范圍內的吸收值與蛋白質濃度的成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質的含量。

紫外吸收法可測定0.1-0.5mg/ml的蛋白質溶液，此操作簡便，測定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質的制備中廣泛應用。

三、雙縮脲法（Biuret法）

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。

四、BCA法

BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應用更加靈活。

蛋白質分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結合生成深紫色的化合物，這種穩定的化合物在562nm處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質的含量。

五、Lowry法

蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質的濃度。

六、考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質通過范德華力結合，在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質結合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。

蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2min即可反應完全，呈現最大光吸收，并可穩定1h，之后，蛋白質―染料復合物發生聚合并沉淀出來。蛋白質―染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質5μL/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10-100μg蛋白質，微量測定法測定范圍是1－10μg蛋白質。此反應重復性好，精確度高，線性關系好。標準曲線在蛋白質濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質結合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。

此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當的緩沖液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X―100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當的緩沖液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。

七、凱氏定氮法

凱氏定氮法用于測定有機物的含氮量,若蛋白質的含氮量已知時，則可用此法測定樣品中蛋白質的含量。

當蛋白質與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。

消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標準無機鹽酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止。根據所用標準鹽酸的量可計算出待測物中的總氮量。

蛋白質的含氮量為16%，即1克蛋白質中的氮相當于6.25克蛋白質，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質的含量。