實驗材料 人食管癌細胞系
試劑、試劑盒 胰酶RNA酶碘化丙啶四甲基偶氮唑鹽小牛血清DMEMDMSOK2HPO4Na2HPO4NaCI
儀器、耗材 無菌分選管400目細胞篩水浴鍋離心機酶標儀電泳儀顯微鏡PCR儀
實驗步驟
一、材料準備
1. 青霉素儲存液
（1）將青霉素小瓶中的80萬單位的干粉充分溶解于8 ml去離子水中。
（2）分裝為1 ml/管，-20℃保存。
2. 鏈霉素儲存液
（1）將鍵霉素小瓶中的1 mg干粉充分溶解于10 ml去離子水中。
（2）分裝為1 ml/管，-20℃保存。
3. RPMI 1640培養基
（1）在大三角瓶中裝入800 ml 去離子水。
（2）加入1袋RPMI1640干粉制荊，于攪拌器上混勻。
（3）加入2.0 g Na2HCO3，1 ml 10萬unit/ml 的青霉素儲存液。
（4）1 ml 充分溶解后，調節pH值至7.4，去離子水定容為1000 ml。
（5）無菌條件下0.22 um 孔徑濾膜過濾后分裝置于4℃保存。
4. UltraMEM培養液
（1）500 ml UltraMEM中加入無菌的10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50U/ml青霉素和50 ug/ml 鏈霉素，4℃保存。
（2）由于完全無血清狀態不利于細胞生長，我們在該培養液中加入5%的FBS，維持FBS呈較低水平。
5. 1×PBS （pH 7.4）
（1）在800 ml去離子水中溶解1.15g Na2HPO4、0.2 g K2HPO4、8.0 g NaCl和0.2 g KCl。
（2）用1 M HC1調pH值至7.4，加水定容為1000 ml。
6. EGF：用1 ml 無菌水溶解安培內的100 ug EGF，分成10管，取1管稀釋100倍分裝成小份作為工作液，其余9管作為貯藏液，均置于-20℃保存。
7. bFGF
（1）用1 ml Tris緩沖液充分溶解安培內的10 ug bFGF
（2）分裝成10管，每管以PBS稀釋10倍后分裝成小份作為工作液，置于-20℃保存。
8. 0.25%胰酶
（1）稱取胰酶0.25 g，以1x PBS 100 ml溶解。
（2）無菌條件下0.22 um 孔徑濾膜過濾后置于4℃保存。
9. 5 mg/ml 四甲基偶氮唑鹽（MTT）
（1）0.5 g MTT粉劑加入100 ml PBS浴液中充分溶解。
（2）無菌條件下0.22um孔徑濾膜過濾后分裝置于-20℃保存。
10. 細胞凍存液：DMSO：FBS=1：9，-20℃保存。
11. Hoechst 33342
（1）將10 mg Hoechst 33342粉劑以無菌水1ml 溶解作為貯存液。
（2）取出10 ul稀釋到40 ul作為工作液，二者均避光，-20℃保存。
12. 碘化丙啶（PI）
（1）將25 mg PI粉劑以1×PBS緩沖液250 ml 避光攪拌至充分溶解。
（2）得到終濃度為l00 ug/ml 的貯存液，過濾分裝后置于4℃避光保存。
13. 10 mg/ml RNA酶
（1）將胰RNA酶溶解于溶劑中[10 mM Tris-HCl（pH 7.5），15 mM NaCl]，濃度為10 mg/ml。
（2）置于100℃15 min，緩慢冷卻至室溫后分裝為200 ul/支，保存于-20℃。
14. Verapamil配制
（1）用DMSO配濃度為50 mg/ml 的原液。
（2）從文獻得知應用液的濃度是100 umol/ml。
（3）所以將原液稀釋50倍后就可以得到濃度為100 umol/ml應用濃度。
（4）實驗中按照每ml細胞懸液中加入10 uL 的原液即可達到阻斷離予通道所需的濃度。
二、實驗步驟
1. 流式細胞儀分選方法：
（1） 0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的鼻咽癌細胞，1200 rpm/min，離心5 min，棄上清后加入5 ml PBS重懸細胞，離心洗滌兩次。
（2）以冰預冷的含2% FBS RPMI 1640完全培養液重懸細胞，調整濃度為1×106個/ml，于37℃培養箱中孵育10分鐘。
（3）加入濃度為7.5 ug/ul 的熒光染料Hoechst 33342至終濃度5 ug/ml，避光，于37℃培養箱中孵育90分鐘，間斷混勻以免細胞沉底。
（4）低溫離心，4℃，1200 rpm/min，5 min，棄上清。
（5）2 ml PBS重懸，1200 rpm/min，5 min。
（6）用2~4 ml RPMI1640培養液重懸細胞，以400目高壓滅菌后的細胞篩過篩細胞，除去粘連細胞團。
（7）于上流式細胞儀前5分鐘加入濃度為50 ug/ml 的PI達到終濃度為1~2 ug/ml，避光標記細胞。
（8）上機分析或分選。
2. 結晶紫染色步驟：
（1）用PBS清洗每孔兩次，去除培養液中的蛋白成份。
（2）每孔加入1.5 ml 100%乙醇，室溫固定15分鐘。
（3）PBS清洗兩次，每孔加入1 ml 4%的結晶紫染料．室溫作用15分鐘。
（4）流水緩慢洗去多余染料，于吸水紙上控干水分，計數細胞數大于50個的克隆數量并計算CFE。
3. 多向分化以及自我更新能力研究：
（1）分選后SP和NSP細胞分別接種于培養瓶中。
（2）培養2周，達到再次分析的細胞數目后收集細胞做Hoechst 33342染色，分析SP細胞比例高低。’
4. 細胞總RNA提取：
（1）采用Trizol Reagent提取細胞RNA。取生長狀態良好的SP和NSP細胞，棄去培養液，0.25%的胰酶消化細胞，用無菌PBS洗2次，加入1 ml Trizol，帶細胞裂解后移入EP管，室溫靜置5 min。
（2）加入0.3 ml 氯仿，顛倒混勻EP管15 sec，室溫靜置3 min，4℃12 000 g離心10 min，緩慢吸取上清于另一EP管中。
（3）加入0.75 ml異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4℃12 000 g離心10 min，棄上清。
（4）加入75%乙醇（用DEPC處理過的去離子水來配制），混合，4℃，7 500 g 離心5 min，棄上清。
（5）室溫干燥，加入20 ul 經DEPC處理去離子水，55℃~60℃水浴10 min 助融，以1：25稀釋后檢測260：280比值以及RNA濃度，分裝，-80℃冰箱保存備用。
5. 小鼠體內成瘤試驗
（1）先用未分選的EC-9706細胞做預實驗來確定接種細胞數目，選取地數量分別為1×106，1×105和1×104，四周后觀察腫瘤形成情況。
（2）將當天上午分選所得到的SP和NSP細胞準確圮數后重懸于RPMI-1640培養液中，分6組接種細胞，接種體積為100 ul。
（3）于4℃保存在動物房中分別注射于NOD/SCID小鼠腋下，每個劑量3只小鼠，SP和NSP細胞共24只小鼠。
（4）飼養4~9周，每周觀察兩次腫瘤生長情況。
（5）處死前用游標卡尺測量腫瘤大小，采取斷頸法處死小鼠，拍照取出瘤組織。
（6）剪取部分用10%福爾馬林浸泡固定，切片進行HE染色確定病理類型。
6. Western Blot分析目的蛋白：
（1）細胞總蛋白的提取
①準備冰盒，以下操作盡量在冰上完成。
②用冰預冷的PBS洗去細胞培養皿中殘余的培養液。
③加入1 ml PBS，用細胞刮將細胞刮下，收集于EP管中，1500 rpm/min，離心5 min 或者1800 rpm/min，離心3 min。
④緩慢吸去上清液，于下層細胞沉淀中加入1 ml 細胞裂解液將細胞裂解，混勻后于冰上放置至少45 min，然后于低溫超速離心機上4℃，12000 m/min，離心5 min。
⑤吸取上清，分裝并檢測蛋白濃度。
（2）標準曲線的繪制以及樣品蛋白的濃度測定
①BSA蛋白標準品的稀釋：將濃度為2000 ug/ml 的原液逐步稀釋得到濃度分別為1500 ug/m，1000 ug/m，750 ug/m，500 ug/m，250 ug/m，125 ug/m和25 ug/ml的標準品梯度。
②配制工作液：按照使用說明將A液50體積與B液1體積混合。
③取5 ul 標準品或樣品，加100 ul 的工作液，室溫混勻30秒。
④37℃孵育30 min 后降至室溫，于570 nm 波長下測OD值，繪制標準曲線并根據稀釋倍數計算蛋白樣品的濃度。
7. 免疫熒光法分析細胞蛋白分子表達：
（1）小心將處理好的蓋玻片用鑷子夾住放入六孔板板中，將分選收到的SP和NSP細胞分別滴加到片子上，利用表面張力將液滴控制在片子范圍內，靜置20~30 min，待細胞貼壁后輕輕補加培養液（注意不要使片子浮起），放入培養箱中培養過夜。
（2）次日，棄去孔中培養液，PBS洗3次，加入10%甲醛，4℃固定30 min。
（3）PBS洗3次去除多聚甲醛，每孔加入1 ml 5%牛血清白蛋白室溫孵育2 h 封閉，阻斷非特異性IgG結合。
（4）PBS洗2次，加入適量CD44和CK18一抗，放置于搖床上4℃過夜。
（5）用PBS-T（含有0.02%Tween 20的PBS）洗滌3次，加入熒光二抗適量，放入暗盒中，置于搖床上室溫結合2小時。
（6）PBS-T洗滌3次，用含有0.5 mg/ml DAPI 的封片液將蓋玻片固定于載玻片上，放入暗盒中避光保存。
（7）于Olympus正置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度，記錄拍照。
