首次在康復病人體內分離獲得人源CCHFV單克隆抗體

　　2018年，世衛組織將包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒、MERS、SARS在內的10種病毒病列為優先考慮的傳染性病原，其中也包括克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV）。

　　CCHFV是一類由蜱蟲傳播的可以引起嚴重出血熱癥狀的烈性病毒，感染致死率通常在5%-30%，但在某些暴發波次甚至高達80%，需要在生物安全4級實驗室中操作。CCHFV隸屬布尼亞病毒目（Bunyavirales）下的內羅病毒科（Nairoviridae），是一類分節段的負鏈RNA病毒。CCHFV通常由攜帶病毒的璃眼蜱屬（Hyalomma）叮咬傳播或接觸被病毒污染的家畜而感染，也曾有院內感染的報道。該病毒已經波及歐亞非多國并形成本地流行，成為傳播范圍最廣的蜱傳病毒。目前尚無特效治療藥物。

　　CCHFV的基因組分成三個節段（S、L、M），分別編碼核蛋白、糖蛋白前體及RNA依賴的RNA聚合酶。依照M節段序列的系統發育關系，CCHFV分為七個分支（clade I-VII）。糖蛋白前體經轉錄翻譯加工，生成病毒囊膜表面的兩種結構蛋白Gn和Gc，及三種分泌型蛋白（GP38、GP85、GP160），其中，Gn負責病毒顆粒對受體細胞的粘附，Gc介導膜融合。類似于其它布尼亞病毒，目前認為內羅病毒屬的Gc也是II型病毒囊膜蛋白，即C端在膜內的單次跨膜蛋白。

　　研究發現，CCHFV感染者血清中抗體的缺失與病人的感染致死率密切相關，提示抗體在保護感染者免于死亡中發揮作用。但目前僅有鼠源抗體發表，分別靶向CCHFV的Gc、Gn和GP38。而根據近期在其它烈性病毒，如埃博拉病毒中的研究，康復患者血中可以分離到具備治療效果的中和抗體，甚至在感染后出現癥狀時再使用依然有效。

　　延續這種策略，2021年6月1日，美國愛因斯坦醫學院的Kartik Chandran教授課題組聯合Adimab、Mapp公司及美國陸軍傳染病研究所的合作者在Cell雜志發表了題為Protective neutralizing antibodies from human survivors of Crimean-Congo hemorrhagic fever的研究文章，首次報道在四名CCHFV感染幸存者體內發現361株靶向Gc和GP38的人源單克隆抗體。實驗證實其中的高效中和抗體靶向Gc上的6個保守抗原表位，靶向表位不同的抗體可以通過協同作用發揮預防效果。進一步將其中的高效抗體改造為雙特異性抗體，獲得了一株可以有效保護小鼠免受致死劑量CCHFV攻毒的抗體。

　　作者首先構建了重組蛋白rGn/Gc作為誘餌，在四位CCHFV康復患者的血樣中進行單個記憶B細胞的流式分選，經過測序，在酵母工程菌株中進行單抗的異源表達，最終得到361株抗體。而后，研究者使用生物膜干涉檢測了全部抗體對rGn/Gc和Gc的結合能力，發現超過80%的抗體均可結合兩種抗原，另有部分抗體特異性結合GP38，但全部抗體均不結合Gn。進一步地，檢測這些抗體對三種分支（Clade III、I、V）來源的rGn/Gc的交叉結合能力，發現絕大部分的Gc特異性抗體均可同時結合三種分支來源的抗原，另有7株GP38特異性的單抗也存在交叉反應。

　　接下來，作者通過比較全部抗體與7個靶向Gc不同表位的Fab片段的競爭實驗，確認大部分抗體均靶向六種表位中的一種。為確認抗體靶向的具體表位序列，作者對上述已進行表位分類的抗體進行表位定位實驗：使用表面表達有Gc突變體的酵母文庫，進行三輪熒光激活的流式分選，通過對Gc突變體的測序，最終確定了6組表位的具體序列信息，并將這些表位信息，在Gc結構模擬圖上進行了定位（圖1）。

　　圖1 抗體的六組表位序列及其在Gc結構模型上的定位

　　為確定篩選出的單抗的中和效果，作者構建了包含全部結構蛋白及Nano-Glo熒光素酶報告基因的病毒樣顆粒tecVLP，可以模擬真實病毒的入侵，用于對小分子和單抗的評估。以恒定的抗體濃度（35 nM），檢測全部抗體對分支IV阿曼毒株tecVLP的中和效果，發現靶向Gc融合肽和結構域II的抗體顯示最強的中和活性，而全部GP38特異性單抗均不具備中和活性。作者還進一步測試了活性較強抗體的廣譜中和能力，確定三株抗體ADI-37801 （表位1，靶向融合肽）、ADI-36121 （表位3，靶向結構域 II）和ADI-36145 （表位6，靶向結構域III）用于后續實驗（圖2）。

　　圖2 高效抗體的中和效果匯總

　　針對此前應用單株抗體進行治療時易導致毒株產生逃逸突變的問題，作者在進行抗體的動物實驗前，先測試了三株候選抗體作為協同抗體對的組合可能。通過將非競爭表位的抗體進行等摩爾比混合，測試了它們對阿曼及另外幾種毒株來源的tecVLP的中和效果，發現ADI-37801可以與另兩株抗體協同。于是，作者測試了三種抗體及兩種抗體組合，在50mg/kg用量下單次注射對小鼠的攻毒預防及保護效果，結果顯示全部抗體及組合在提前24小時注射時，均可以有效保護，但在攻毒后使用時則未能有效保護小鼠。為獲得保護性效果，作者對三種抗體的可變區進行組合構建出4株雙特異性抗體，經異源表達和純化，分別測試了這些雙特異抗體對不同tecVLP的中和效果，發現攻毒24小時后一次注射DVD-121-801即可有效保護小鼠；結果還顯示，雙特異抗體的構建方式影響其保護效果，兩組抗體V區位置交換的DVD-145-801則不具備保護效果（圖3）。

　　圖3 雙特異抗體構建策略及動物實驗結果

　　在本項研究中，作者首次在康復病人體內分離獲得數百株人源CCHFV單克隆抗體，這些抗體大多靶向Gc上的6個保守表位，部分抗體具備較強的中和活性和預防效果，通過抗體改造還獲得一株具備治療效果的雙特異抗體，有望用于后續臨床開發。當然，本文也存在一些問題，如近400株抗體無一靶向Gn的原因尚無定論，高效中和抗體的確切作用機制還有待結構生物學研究，本研究發現的抗體在非人靈長類及人體中的效果仍需確認。但這種從康復患者血漿中直接分離單個B細胞并通過體外實驗快速鑒定候選中和抗體的策略，可推廣至其他尚無有效治療手段的病毒防控中。