半世紀來，科學家們假設外源DNA介導的基因改造技術可能成為對人類遺傳疾病的一種有效治療手段，雖然將理論運用于臨床實踐的過程漫長而曲折，但基因治療已經成為攻克遺傳性耳聾的一項嶄新治療模式而充滿希望。從內耳的解剖特點看,由于耳蝸骨迷路和內耳血迷路屏障的存在，耳蝸成為一個相對獨立的器官,為內耳基因治療提供了理想環境[1]。內耳基因治療領域正在快速發展，隨著不同的新型載體的發現以及耳聾遺傳學動物模型研究的逐漸增多，國內外開展的內耳基因導入研究也逐漸增多，但研究的關注點多在外源基因在宿主細胞的轉染率，以及基因表達的分布，而較少的關注導入手術前后聽覺功能的變化及保護。因此，探索一種轉染效率高，同時又能較好地保護患者聽力的基因導入技術十分有必要。
目前內耳基因的導入途徑分為兩種:聽泡內途徑和聽泡外途徑。其中聽泡內途徑包括經圓窗途徑和圓窗外途徑。前者有：經圓窗顯微注射，圓窗龕明膠海綿+介質粘貼等途徑；后者有：鼓階切開，前庭階切開及中階切開等途徑。聽泡外途徑包括后半規管切開，內淋巴囊途徑及聽泡外鼓階顯微注射等途徑。而其中的內淋巴囊途徑和中階注射切開途徑屬于內淋巴導入，其余為外淋巴導入[2]。本文將從近年來國內外對于內耳基因導入的研究中回顧有關內耳手術入路與聽力保護相關的資料，從而比較經圓窗途徑、耳蝸開窗、半規管途徑等的轉染率及聽力保護差異。
1 圓窗途徑
1.1 完整圓窗膜滲透導入法
圓窗膜途徑是一種低侵入性載體導入技術，被認為是從中耳傳遞潛在毒性物質到內耳的主要途徑。臨床上，如：向內耳導入激素，慶大霉素已被用于治療突發性耳聾以及治療梅尼埃病相關的眩暈。
該途徑的優點是：1.未損傷耳蝸結構，基本不造成內耳炎癥及損傷。2009年Chen通過完整圓窗膜滲透法向豚鼠導入以重組腺病毒為載體的Math1基因，發現完整圓窗膜實驗組外毛細胞點狀缺失，轉導成功率為50%，術后聽力與術前比較無差異。耳蝸形態學研究顯示該方法不會導致中耳及內耳，尤其是圓窗膜的炎癥和破損[3]。2014年Cheng進一步驗證該方法是微創，安全的[4]。2.能成功轉染載體到耳蝸導管附近耳蝸組織，螺旋神經節細胞及毛細胞，聽覺功能保護良好。2001年Jero從小鼠完整圓窗膜滲透導入脂質體復合物，在小鼠導入耳同側的螺旋緣，螺旋神經節細胞及前庭膜發現有表達[5] 。Jero將脂質體載體和腺病毒載體(腺相關病毒則無效)轉導入小鼠的耳蝸時，成功地將外源基因通過完整的圓窗膜導入耳蝸組織中并得到表達[6]。
其缺點則是：1.載體導入具有病毒選擇性。如2001年Jero在向小鼠耳蝸導入腺病毒時引起了圓窗膜水腫，作者認為早期的水腫有增加圓窗膜滲透性的可能，然而長期的水腫必然引起圓窗膜的增厚及局部炎癥反應，影響載體的導入。因此選擇適宜類型的病毒或者非病毒性載體十分重要。2.載體的分布表達不均。如2015年Wang運用納米級別的復合物顆粒制作基因載體，成功經圓窗膜滲透途徑導入豚鼠耳蝸，其中毛細胞的表達如下：底轉外毛細胞81.7±4.71%，中轉可達33.8±9.02%，內毛細胞只表達在中轉以下，且僅為8.9±1.85%。其他研究數據均發現底轉表達較多，頂轉表達較少，存在分布不均的現象[7]。
綜上所述，該途徑侵入性低，是一種理想的導入手段，其研究重點是選擇更具靶向性，分子量小，對細胞毒性小，轉染效率高的載體。以及探索新的滲透劑量，濃度和速度，使表達分布更加均勻。
1.2 圓窗膜注射法
圓窗膜注射法是經耳蝸的天然入口通往鼓階的一種入路，可以保護聽力，有較高的轉染效率和較少的耳蝸損傷和聽力損失。但真實的轉染效率與聽力保護結果與實驗注射設備選擇，液體導入體積，導入速度，及術后組織覆蓋，是否發生外淋巴瘺有關。同時，圓窗膜注射法也是應用最廣的一種導入途徑。
其優點是:1.轉導率較高:2003 年Praetorius 等用腺病毒( Ad5)，經圓窗膜顯微注射方式導入小鼠耳蝸，術中使用立體固定架固定頭部，用36號針頭注射。發現導入后24小時GFP在螺旋韌帶、內毛細胞、螺旋神經元上有很強的表達，外毛細胞相對較弱[8] 。而2009年Xu同樣經圓窗膜向小鼠耳蝸導入Ad-EGFP，術后出現聽力喪失。分析原因可能有兩點:一是損傷圓窗膜且填塞圓窗龕(防止外淋巴漏)，影響兩窗相位差從而影響術后聽力；二是顯微注射后可能發生前庭膜破裂，也是術后聽力喪失的一個重要原因[9]。
2. 表達的均勻程度較高:如2015年Akil等從圓窗膜穿刺，用腺相關病毒1 型(AAV-1) 運載VGLUT3基因(AAV1-VGLUT3)導入新生小鼠耳蝸,實驗結果表明轉染基因表達在內毛細胞，外毛細胞和支持細胞，認為其轉染率和表達的均勻程度較高, 未造成明顯的Corti氏器損傷。并且持續時間長達1年半，這與其他動物模型和其他器官系統的表達時間一致，避免了耳蝸細胞的損傷[10] 。該實驗在進行注射前先刺破圓窗膜至未見有液體流出時再進行導入，可能這種釋放淋巴液的方法有一定的平衡液體壓力的作用。2017年Shi等通過圓窗膜導入AAV1，并觀察其在小型豬及豚鼠耳蝸內的表達。發現AAV1在二者毛細胞中均有表達,在小型豬上，2、3、4 周的表達率分別為12.00 ± 5.72%，66.50 ± 4.65%，48.25 ± 3.77%。3周時在內毛細胞中均勻表達。2、3、4 周在內毛細胞，Hensen’s 細胞，內柱外柱細胞，螺旋韌帶，螺旋緣及前庭膜上均發現表達。在豚鼠上第2周開始出現在毛細胞的整個底回區域，表達率為84.60±4.56%(達到峰值)，3周為63.40 ± 3.21%[11]。此外，2012年Shibata認為圓窗膜注射在透明質酸(HA)的作用下使得轉染的覆蓋面比耳蝸開窗術更廣，并且在不伴有耳蝸內液體自然稀釋的作用下通過HA的作用下實現主動分布[12]，這種作用在Bjurstro ?m 的文獻報道中推測是在圓窗膜上增加了液體的滲透壓。以及增加了膜的滲透性，以及HA本身的高粘度使得試劑與圓窗膜有長時間接觸的過程有利于注射物的轉導[13] 。
2 耳蝸開窗術
2.1 鼓階開窗
理論上來說，在Corti 器中，科蒂淋巴成份與外淋巴相似，通過韁孔及骨螺旋板中的小孔與鼓階中的外淋巴相通。毛細胞頂部表皮板與內淋巴接觸，其他部分浸浴在科蒂淋巴中并由其供應營養。這種結構構成了經鼓階外淋巴導入外源基因在Corti 器上得以表達的解剖學基礎。
其缺點包括：1. 鼓階打孔造成的底回淋巴液波動對應于聽力高頻部分，鼓階開窗有較大可能損害高頻聽力。2007年Kanzaki提出腺病毒相關的神經膠質細胞源性的神經營養因子的鼓階注射，在鼓階注射后在4kHz和8kHz處ABR升高約30dB SPL，在16kHz處為超過40dB SPL[14] 。2009年Chen Wei在探索Math1基因的內耳導入徑路時，實驗組及對照組可見片狀外毛細胞缺失，內毛細胞個別缺失。ABR在8kHz時較術前升高，16kHz，20kHz較術前明顯升高。作者認為這種損傷主要是手術操作造成的，機理可能為，耳蝸鼓階打孔以及病毒懸液的注入引起了耳蝸底回外淋巴液的強烈波動，對應于聽力高頻部分(16 kHz，20 kHz)，低頻閾值升高的現象有可能是病毒的生物毒性和免疫反應造成的[3] 。為加強對聽力的保護，2009年李利等運用微量注射器及微量泵向小鼠耳蝸鼓階導入胚胎干細胞5ul，發現胚胎干細胞可經耳蝸底轉鼓階打孔途徑導入耳蝸，干細胞在內耳成功存活，并且對內耳損傷小(術前、術后閾移10dB SPL左右)[15] 。2011年Kilpatrick認為在向鼓室注射人工外淋巴液時當注射速度在16-32nl/min的區間時能提供好的聽力保護結果[16]
2.存在導入載體分布不均的現象. 2012年Shibata在實驗中發現通過耳蝸底轉的鼓階注射后，轉基因表達eGFP分布受限，主要是在前兩回的鼓階，更高回表達的缺乏可能是由于外淋巴的“逆流”以及腦脊液由于向缺口流動造成的阻力[12] 。2013年Wei總結通過圓窗膜運用微型注射器或者泵將半病毒載體泵入耳蝸鼓階，載體的表達受限于鼓階和前庭階的內壁細胞，在Corti器及螺旋神經節處未發現表達[17]。
綜上所述，鼓階打孔的基因導入方式會引起ABR 10dB SPL左右的閾移，降低載體導入體積和導入速度可一定程度上保護聽力。如何選取與內外毛細胞更親和的表達載體及濃度，提高內外毛細胞轉染效率，精確控制載體導入體積和速度是研究的重點。
2.2 中階開窗
相對于經鼓階外淋巴導入表達載體，中階內淋巴導入對于接觸內外毛細胞更為直接，聽力損傷則大于鼓階。
其優點是：有較高的細胞轉染效率。2007年Kanzaki指出病毒通過內淋巴及中階的外側壁進入到感覺上皮細胞，螺旋神經節細胞及血管紋細胞。載體可能通過螺旋神經節形成的神經的韁孔進入神經。從中階導入豚鼠內耳的途徑特別適用于螺旋神經節細胞[14]，2016年Shu等向新生小鼠中階導入腺病毒GFP載體，發現所有種類的腺病毒在不同日齡均在底轉和中轉的螺旋神經節細胞有表達，其中Ad-GFP-Baylor 組在P0轉染率最高，底轉、中轉分別90.8±9.2，84.7±10.6，耳蝸各轉內毛細胞，外毛細胞，螺旋神經節細胞均有不同組病毒不同程度的轉染，作者認為向小鼠中階導入載體可提高轉染效率。
其缺點最顯著的是造成聽力損失較大，聽力測試顯示中階注射組的聽閾高于鼓階注射組。可能的原因有：1. 向該處注射過多體積的載體于內淋巴可能會引起機械損傷[18]。2002年Ishimoto等認為中階注射時，大量的外毛細胞已經被破壞[19]。2. 中階注射增加了內淋巴液的液體壓以及造成前庭膜的破裂從而造成耳蝸內的內外淋巴液混合,混合的淋巴液改變了內耳內環境的Na+和K+的動態平衡。3. 注射處同樣造成了螺旋神經節和血管紋的破壞，直接進入的流動液體在蓋膜的反作用下給Corti器造成了沖擊損害，該壓力同樣能損害毛細胞。4. 內淋巴液在穿刺處的過量漏出將降低耳蝸內的跨膜電位，這將為細胞產生正常的機械運動造成阻礙[16]。
聽力保護方面，2011年Kilpatrick運動納米微量注射泵從中階向小鼠耳蝸導入腺相關病毒，術后小鼠中低頻聽力(4kHz-22.6kHz)未發現明顯改變，高頻聽力(32kHz，40kHz，45.2kHz)下降，他認為手術的聽力保護機制有:①納米微量導入系統的使用可控制注射液體的體積與速度到納米級,最小液體體積可達到4.6nl，根據小鼠中階內淋巴液體積只有0.19ul，本次注射的量為每次0-4.6nl，間隔一分鐘。可使得耳蝸細胞逐漸適應內淋巴壓力環境的改變而減少損傷。②外科操作方法采用標準非侵襲性步驟，中階骨性外側壁用牙科鉆磨薄，保留膜性外側壁的完整，整個操作過程內淋巴間隙保持完整，從而使得玻璃微量注射器的尖端刺入膜迷路外側壁時不伴有內淋巴液漏出。此外也有不同的科學家提出了其他的聽力保護機制，如:1.小體積注射，出生早期導入病毒。2013年Wang等將腺相關病毒和慢病毒導入小鼠耳蝸，試圖探究一種病毒通過中階導入合適時期的聽力保護策略。本次實驗采用了小體積(0.2ul)量的病毒注射，在大多數類型的內耳毛細胞發現表達發現各種病毒在血管紋的邊緣細胞和中間細胞表達最高并且在小鼠出生后早期病毒導入時可保護聽力[20]。2.分處注射和緩慢注射。2017年Gao等運用基因編輯技術通過耳蝸中階導入Cas9-guide RNA復合物改善小鼠模型的人類遺傳性耳聾，發現注射組相對于未注射組ABR聽閾在5.66kHz有輕微升高，在8kHz及以上頻率無明顯改變，聽力保存較好[21] 。分處注射和緩慢注射可能與聽力保護有關，Kanzaki指出，5ul的病毒注入未發現對側轉染，而25ul的導入則會引起對側轉染，因此病毒在轉入組織的分布可能與導入病毒的體積有關。
2.3 前庭階入路
目前該入路的相關研究較少，可能是由于前庭階解剖結構的復雜性導致。2009年徐金操通過前庭階打孔的方式，向大鼠內耳導入Ad-Math1-EGFP，導入三天可在耳蝸組織鋪片的耳蝸基底膜，球囊，橢圓囊和半規管壺腹嵴感覺上皮上良好表達。在冰凍切片的Corti氏器外毛細胞及支持細胞均有表達。同時耳蝸和前庭球囊斑也有良好的表達，且毛細胞纖毛形態正常，表皮板，網狀表面及毛細胞之間的連接清晰可見。作者認為前庭階導入與鼓階導入相比，在解剖上更接近前庭器官，導入病毒后濃度高，在前庭器官的表達時間更早，效率更高。同時前庭膜與基底膜的通透性不一致，基底膜比前庭膜厚而致密，因此從鼓階導入載體比從前庭階導入更難到達中階[22]。2010年徐金操運用前庭階打孔的方法將Ad-Math1 -EGFP 成功導入大鼠耳蝸。觀察可見導入Ad-Math1-EGFP7天后，耳蝸前庭毛細胞均未受到損害，與正常對照大鼠相比，組織形態正常，觀察到內耳注入腺病毒一個月后，通過冰凍切片，在熒光顯微鏡下仍可見EGFP 的表達，同時術后游泳實驗，CDM-CEP 閾值，Click 的ABR閾值與術前均無明顯差異，可表示前庭功能及聽覺功能未受明顯損傷[23]。
3 前庭及內淋巴囊入路
3.1 前庭橢圓囊注射
許多的研究者研究此區域的藥物損傷后毛細胞再生問題。2002年Praetorius測試了一種新的內耳基因導入的方法，他運用1型單純皰疹病毒作為載體，運用在橢圓囊開一個小窗的辦法，有效地將β-半乳糖苷酶的報告基因導入耳蝸，并在幾乎所有的前庭及耳蝸的神經元上進行表達而沒有造成聽力損失。
3.2 內淋巴囊入路
在內耳液體微循環理論中包括兩個學說，一個是Corti提出Guild補充和完善的縱向流動學說認為內淋巴囊具有吞噬和液體重吸收作用。第二個是輻射流動學說，Naftalin和Lawrence發現內淋巴在耳蝸和前庭各處局部的分泌上皮產生，同時也在這些相應的部位重吸收。內淋巴的生成及吸收均在膜迷路內完成。內淋巴囊是內淋巴的主要吸收部位，內淋巴囊中間部，細胞具有活躍的離子運轉功能和吞噬作用。在內耳容量，壓力電解質平衡調節中起著重要作用[24] 。有文獻顯示，內淋巴入路可以作為一種鼓階入路的補充入路，1999 年的Yamasoba通過內淋巴囊入路將腺病毒載體Ad.RSVntlacZ 導入豚鼠內淋巴囊，內淋巴管，在前庭，壺腹，甚至耳蝸都有表達，主要是在內淋巴區域，血管紋的邊緣細胞和Corti氏器的支持細胞等[25]。
4 半規管入路
2001年Kawamoto首先提出半規管手術入路，成功導入了巨細胞病毒啟動子表達細菌基因lacZ的腺病毒載體(Ad.CMV–lacZ) 。不僅在前庭和耳蝸發現了病毒的導入，并且也實現了對耳蝸功能的保護。這種手術入路是來源于治療人類良性位置性眩暈時的選擇性迷路切除術[26] 。
其優點包括：1.在新生小鼠上已經實現載體在聽覺細胞上的高表達。2012年Gassner在大鼠上進行后半規管的基因導入，發現在前庭和耳蝸的毛細胞都有表達，血管紋上的表達尤其顯著(數據未顯示)[27]。2017年Isgrig等在研究Useher綜合征時，成功從新生小鼠后半規管向前庭系統及耳蝸導入腺相關病毒2/8 (AAV8-whirlin)，發現經半規管導入病毒在內毛細胞中的轉導率(71.7-81.2%)較先前的圓窗導入法(15%)有提高[28]。2018年Isgrig等在新生耳聾伴前庭功能障礙小鼠(漩渦小鼠)內耳，研究后半規管入路的基因導入手段，成功將腺相關病毒導入新生小鼠前庭及耳蝸，前庭毛細胞(橢圓囊毛細胞)的轉染率為53.1%，耳蝸內毛細胞的轉染率為77.1%[29]。
2.實現了耳蝸功能的保護從而保護聽力。其保護機制有兩方面1.操作上較易，如2003年Nakagawa將新霉素溶液(NM)經后半規管途徑(PSCC)導入小鼠內耳認為PSCC和水平半規管途徑(LSCC)在顳骨外較易分離，此外，由于水平半規管和后半規管的管壁骨質較薄,因此較易將26號針頭刺入[30]。2.半規管組導入基因可同時到達前庭系統和耳蝸系統，比耳蝸開窗法有較低的風險傷到血管和神經[26]。
分析半規管入路轉染率較圓窗路徑高的原因，Isgrig認為嚙齒類動物在耳蝸底轉的圓窗旁有大的耳蝸導水管，導入的病毒可能被耳蝸導水管里的腦脊液稀釋或者從此處流失，而降低病毒濃度從而無法轉染分布整個耳蝸。缺點：不能區分套管是否接觸到內淋巴，骨質和套管的接觸處難以用膠封閉，形成漏洞導致內外淋巴液漏(Kawamot)。這種基因導入手段也為探索其他突變基因的導入和臨床應用提供參考。是一種有希望應用于治療人類遺傳性耳聾，前庭功能障礙疾病的手段。然而小鼠模型畢竟和人體有差異。
5 未來的發展和展望
目前通過手術方法進行內耳的基因導入的手段已經相對成熟，從圓窗入路到耳蝸開窗，以及前庭注射和半規管注射等，但是仍然存在一些問題，比如大多數文獻只說明了轉染率的多少而沒有明確指出導入的成功率的問題,對于大動物實驗而言，再高的表達率，成功率低則意味著對實驗動物的浪費，解決此問題則需要更完善和標準的實驗流程的制定。轉染效率上：中階的導入最為直接有效，但因為直接進入內淋巴，對導入液體體積和速度要求最高。前庭階則是介于中階和鼓階之間的一種導入方式，并且在前庭的分布也相對于鼓階和中階有優勢，是一種有潛力的入路手段。鼓階的導入研究相對較多，如何達到耳蝸各轉的均勻分布十分重要。多處開窗，及釋放外淋巴減壓等手段能否保護聽力，需要進一步驗證。此外，提高圓窗膜通透性，從而提高載體轉染率的外界條件也需要深入研究。聽力保護問題上：圓窗膜注射和半規管入路目前聽覺功能保護優于耳蝸開窗入路。
當前，大動物模型的構造已成為實驗研究的發展趨勢。進一步探索豬的內耳結構，如：耳蝸導水管與圓窗的距離，內外淋巴液的流體壓力，探索最適合聽力保護的導入量和導入速度。并制定規范的實驗操作標準，對提高轉染成功率十分必要。