1 材料 地塞米松磷酸鈉注射液(江蘇第三制藥廠,批號000706) ;RPMI - 1640 培養基(GIBCO ,USA)(每升含10 %小牛血清、L-谷氨酰胺0. 33mg、青霉素100u、鏈霉素100u、pH-7. 4) ; 胰蛋白酶(Difco ,Lot :12885655) ; 四甲基氮唑鹽(MTT) ( FLUKA , Switzerland) ;FLUO-3/ AM(CALBIOCHEM,Ca) ; 二甲基亞砜(DMSO) (MERCK,USA) ; SOD 與MDA 試劑盒(南京建成生物工程研究所) ;吖啶橙(AO) 、溴乙啶( EB )(FLUKA ,Switzerland) ;酶標儀(BIO-RAD ,USA) ;熒光顯微鏡(OLYPUS ,Japan) ; 激光共聚焦顯微鏡(BIO-RAD 公司MRC-1024 型,USA) 。SD 大鼠(南京中醫藥大學,動物合格證號:SCXK(蘇) 2002-0012) 。
2 骨骼肌細胞原代培養 取出生1d 的SD 大鼠四肢肌肉,切碎后用37 ℃的消化液(0. 05 %膠原酶和0. 25 %的胰蛋白酶) 消化兩次,每次15min。經Percoll 密度梯度離心后,收集細胞,用Hank′s 液洗兩次,199 細胞培養液(10 %胎牛血清) 懸浮細胞,接種入細胞培養皿。37 ℃培養12h 后收集未貼壁細胞并計數,種入細胞培養板,37 ℃培養 。待細胞生長并融合進行如下實驗。
3 細胞增殖測定(MTT 比色) 設地塞米松大(5mmol/L) 、中(1mmol/L) 、小(0. 2mmol/L) 劑量組,于加藥培養后的第24h 從96 孔培養板中吸取100μl 培養上清液,每孔加入25μl 濃度為5mg/mlMTT溶液后,繼續培養4h ,吸去舊培養液,再向各孔加入100μl 的二甲基亞砜(DMSO) 100μl ,振蕩5min ,等細胞代謝MTT后所形成Formosan 充分溶解后,用酶聯免疫檢測儀測定490nm 處的吸收度值。
4 SOD MDA 測定 于加藥培養后的第24h 從96孔培養板中吸取的100μl 培養上清液,按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明進行測定。
5 形態學方法 將骨骼肌細胞接種于處理過的載玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h 后,分別收集上清細胞及貼壁細胞,加吖啶橙和溴乙錠(AO/E
染液,在熒光顯微鏡下觀察活細胞(VN) ,核染色質著綠色并呈正常結構;早期凋亡細胞(VA) ,核染色質著綠色呈固縮狀或碎裂狀; 晚期凋亡細胞(NVA) ,核染色質著橘紅色呈固縮狀或碎裂狀;壞死細胞(NVN) ,核染色質著橘紅色并呈正常結構。并計算損傷率:
損傷率= [ (VA + NVA + NVN) / 總細胞數] ×100 %。
6 鈣離子動態變化的測定 用敏感性鈣指示劑FLUO-3/ AM,結合激光共聚焦顯微鏡(Laser ScanningConfocal Microscopy ,LSCM) 檢測技術,分析細胞內鈣離子的動態變化 。儲備的FLUO-3/ AM用D-Hanks液稀釋至5μmol/L ,取10μl 加于培養的骨骼肌樣品上,置5 %CO2 孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks 液洗1 次,再用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察FLUO-3/ AM染色的骨骼肌某一層面的螢光圖像。取地塞米松10μl 輕輕加入孔中,使終濃度達到1mmol/L,迅速以間隔4s 的速度掃描,計算機記錄儲存掃描結果, 使用軟件為Time Course ( Kinetic ImagingSoftware for MRC-1024 and MRC-1024UV Confocal Imaging Systems) 及Lasersharp 數據處理軟件。