高效毛細管電泳儀在核酸分析中的應用

        高效毛細管電泳儀（CE）是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離，是分析科學繼高效液相色譜儀之后的又一重大進展，使分析科學從微升級進入到了納升級水平，不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能，也使蛋白質和核酸等生物大分子分析有了新的轉機。

一、在DNA測序中的應用：

        人類基因組計劃對人類基因組DNA全序列測定隨著電泳從平板凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、線性高分子溶液毛細管電泳，到毛細管陣列電泳技術的發展，已于2001年宣布提前完成，被公認為是分析化學家拯救了人類基因組計劃。對其它生物的DNA測序仍在繼續，方向主要是提高測序速度、準確度和大分子片段的認讀長度。人類基因組計劃提前完成的關鍵是DNA測序方法的改進，而CE就是一種比較適合快速、靈敏、準確、廉價和自動化等要求的方法之一。

  1、毛細管凝膠電泳（CGE）：

        CGE是將平板凝膠電泳的凝膠移到毛細管中作支持介質的電泳，可按照分子大小進行分離。常用支持介質有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。1990年，首次用CGE進行DNA序列測定的嘗試，并初步獲得成功，隨后凝膠的制備和新分離模式迅速發展。CGE與LIFD相結合，成為DNA快速序列分析的優選方案之一，并對人類基因組計劃的完成發揮了重要作用。

  2、線性高分子溶液毛細管電泳：

        雖然CGE是CE中分離度極高的一種模式，但CGE的凝膠柱制備和應用仍然存在問題，如凝膠形成、電泳中氣泡的產生和使用過程中焦耳熱對支持介質的降解使毛細管壽命縮短等。而在低粘度的非交聯線性高分子溶液DNA測序中，高分子溶液可更換，使壽命延長。1993年，首次使用線性聚丙烯酰胺進行DNA測序。隨著技術的不斷改進，線性高分子溶液毛細管電泳采用程序升溫已用于DNA限制性片段快速分離，采用脈沖電場毛細管進行DNA測序，分離的DNA片段可達1000bp。

  3、毛細管陣列電泳（CAE）：

        一般的CE很難做到傳統聚丙烯酰胺凝膠電泳所具備的多通道同時分析，利用共焦激光熒光掃描檢測系統解決了由多根毛細管組成的毛細管陣列同時檢測的問題，這一技術被稱為毛細管陣列電泳（CAE）。CAE無需凝膠，樣品用量少，提高了效率，降低了測序成本，并實現了自動化，加快了速度，但仍有必要進行更高通量的檢測和進一步降低費用。CAE曾成為人類基因組計劃第二個五年計劃（1998～2003年）對DNA測序的三條發展途徑之一。

        檢測器一般分為掃描光學檢測器和電荷耦合元件（CCD）陣列檢測器兩類。放射性陣列毛細管微板與掃描器聯用，可實現高通量的DNA檢測，96個樣品采用壓力式毛細管陣列平行進樣，可使96個PBR322限制性內切酶片段在120s內得到高效分離。若同時使用40塊微板，每塊微板上有384個分離通道，則一次進樣量可達15000個，從而達到高通量DNA分析和測序的目的。此外，CE不僅可對DNA的合成片段進行純度檢驗，對PCR擴增的DNA模板進行純化和從反應體系中去除，還可進行文庫建立或復制，啟動子作用方式檢測自然和人工合成RNA的結構。

二、在基因突變分析中的應用：

        基因突變分析是遺傳性疾病基因診斷和致病基因分離鑒定的基礎，突變是一個或多個脫氧核糖核苷酸的構成、復制或表形功能的異常變化，即遺傳物質結構改變引起遺傳信息改變。隨著對疾病病因和發病機制研究的不斷深入，人類對疾病的認識逐漸深入到基因診斷的水平，傳統技術多用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離野生型DNA分子和突變DNA分子，但費時、費力，不適合自動化，而CE可快速獲得基因突變模式的信息。基因突變分析主要分為未知基因突變分析和已知基因突變分析，在實際應用中，許多檢測未知基因突變的方法也可用于檢測已知基因突變。

        CE用于基因突變分析的方法有單鏈構象多態性分析、限制片段長度多態性分析、異雙聚體DNA多態性分析、雙脫氧指紋譜圖分析和毛細管電泳分子信標技術等。

  1、毛細管電泳－單鏈構象多態性分析：

        單鏈構象多態性分析檢測基因突變的原理是將DNA變性形成單鏈，由于核苷酸不同而形成不同的二級空間構象。在毛細管電泳－單鏈構象多態性分析中，遷移速度主要取決于其二級空間構象，不同單鏈的DNA的遷移速度不同。如果基因的某些位點發生堿基突變，會引起單鏈DNA二級空間構象的改變，可在一定介質中用CE檢測突變的基因。毛細管電泳－單鏈構象多態性分析與平板凝膠電泳相比，在分離速度和分辨率等方面具有明顯的優勢，是一種快速、簡便檢測基因突變的技術，適用于未知突變基因的篩選。

  2、聚合酶鏈反應－限制片段長度多態性分析：

        基因突變常引起某一區域限制性內切酶的酶切位點消失或因突變產生新的酶切位點。用適當的酶進行酶切時，突變基因產生與正常基因長度不同的片段，用CE分離時會產生代表不同片段長度的峰。適用于某個已知固定位點基因突變的檢測。

  3、異雙聚體DNA多態性分析：

        異雙聚體DNA多態性分析是利用構象多態性引起電泳遷移速度改變，檢測DNA非限制性位點突變，可快速、高效地篩選突變基因，整個分析時間不超過30min。

  4、雙脫氧指紋譜圖分析：

        雙脫氧指紋譜圖分析是將雙脫氧核苷酸測序和單鏈構象多態性分析相結合的分析方法。

  5、毛細管電泳分子信標技術：

        毛細管電泳分子信標技術可對核酸進行實時檢測，也可用于活體內核酸的動態檢測。