高效毛細管電泳儀的技術發展與應用

        高效毛細管電泳儀簡稱毛細管電泳儀（CE），是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，利用帶電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離，是分析科學繼高效液相色譜儀之后的又一重大進展，使分析科學從微升級進入到了納升級水平，不僅使單細胞乃至單分子分析成為可能，也使蛋白質和核酸等生物大分子分析有了新的轉機。

一、毛細管電泳的發展歷史：

        毛細管電泳是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物，一出現就引起分離科學界極大的關注。目前，它已成為與20世紀60年代初出現的氣相色譜儀和20世紀70年代初出現的高效液相色譜儀相媲美的一種分離技術，井被認為是當代分析科學zui具活力的前沿研究課題。

        1937年，發明U形管移動界面電泳儀。這可看作是毛細管電泳發展的開端。

        1967年，zui先在3mm內徑的毛細管中作自由溶液的區帶電泳。

        1974年，用200～500μm內徑的毛細管作區帶電泳分離。早期的研究受當時檢測靈敏度的影響，未獲得預期的高效分離效率，但為毛細管電泳的發展奠定了基礎。

        1981年，用75μm內徑的石英毛細管在3萬伏高壓下實現40萬理論塔板數的空前分離效率，這一工作被認為是現代毛細管電泳發展的里程碑。隨后毛細管電泳的研究急速升溫，許多大科學家也開始參與研究。

        1984年，使用含表面活性劑的背景電解質，開辟了毛細管電泳另一個重要分支－毛細管膠束電動色譜。

        1987年，結合傳統的等電聚焦電泳和凝膠電泳原理，實現了毛細管等電聚焦電泳和毛細管凝膠電泳。

        1988年，實現了微量制備的可能性，提取和分離了50μmol的蛋白質、肽和寡核苷酸等。

        上世紀80年代末，毛細管電泳的研究非常活躍，90年代起在技術和應用等方面都有了很大發展。

        1989年，推出*批高效毛細管電泳儀。

        1990年，改進和應用了紫外檢測器。

        1992年，激發誘導熒光檢測器誕生，毛細管電泳技術得到不斷改進和更新，靈敏度和分辨率均達到預期的高效分離效率。

二、毛細管電泳分離模式的發展：

        CE分離模式有毛細管區帶電泳（CZE）、毛細管膠束電泳色譜（MECC）、毛細管凝膠電泳（CGE）、毛細管等電聚焦電泳（CIEF）、毛細管等速電泳（CITP）、毛細管陣列電泳（CAE）和毛細管芯片電泳（Chip）等。

  1、毛細管區帶電泳（CZE）：

        CZE又稱毛細管自由電泳，由于操作簡單、多樣化，是目前CE中zui基本、應用zui廣泛的一種分離模式。

在CZE中，毛細管內只充入緩沖溶液，在直流高壓驅動下．溶質以不同的速度在分立的區帶內進行遷移而被分離，由于電滲流的存在，正負離子都可用CZE分離，而中性分子本身在電場中不移動，隨電滲流一起流出毛細管。

        CZE的應用范圍很寬，可分離氨基酸、多肽、離子和對映體等。

  2、毛細管膠束電泳色譜（MECC）：

        在MECC中，把一些離子型表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉）加到緩沖液中，當其濃度超過臨界膠束濃度后，形成有一疏水內核、外部帶負電的膠柬。溶質在水相和膠束相（準固定相）之間產生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異而得以分離。MECC使CE能用于中性物質的分離，拓寬了CE的應用范圍，是對CE的極大貢獻。

  3、毛細管凝膠電泳（CGE）：

        CGE是將平板上的凝膠移到毛細管中作支持物而進行的電泳，凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，溶質按分子大小進行分離。凝膠能減小溶質的擴散，峰型尖銳，能達到CE中的zui高柱效。常用聚丙烯酰胺在毛細管內交聯制成凝膠柱，可分離測定蛋白質和DNA等，但柱制備比較困難，使用壽命短。

  4、毛細管等電聚焦電泳（CIEF）：

        CIEF是將傳統聚焦電泳轉移到毛細管中進行，通過管壁涂層使電滲流減小到zui小，以防止蛋白質吸附和破壞穩定的聚焦區帶。在高壓作用下，毛細管內部建立pH梯度，蛋白質在毛細管中向各自的等電點聚焦，形成明顯的區帶。

  5、毛細管等速電泳（CITP）：

        CITP是一種較早的分離模式，采用先導電解質和后繼電解質，使溶質按其電泳淌度不同得以分離，常用于分離離子型物質。但要采用不連續緩沖液，分辨率差，目前應用不多。

  6、毛細管陣列電泳（CAE）：

        為了滿足大批量樣品的分離要求，特別是在人類基因組和蛋白組計劃中的應用，CAE漸漸呈現出了廣闊的應用發展前景和趨勢。與傳統聚丙烯酰胺凝膠板電泳可進行多道平行分析相似，CAE是采用多根毛細管組成的陣列進行多道分析。

  7、毛細管芯片電泳（Chip）：

        當今，分析儀器和分析科學正經歷著深刻的變革，其中一個發展趨勢就是化學分析儀器的微型化、集成化和便攜化，以往一個大實驗室的工作量（大量樣品、試劑、很多分析和合成時間等），今后將在一塊小小的芯片上完成。近年來，毛細管芯片電泳（Chip）的蓬勃發展正是順應這一趨勢。由于CE采用電場驅動，進樣能通過電場實現，因此相應的技術和裝置比較容易微型化。

        Chip是以晶體硅、石英玻璃、有機玻璃、陶瓷和硅橡膠為基體材料，采用毛細管電泳技術，將樣品進樣、分離和檢測等過程集成到一起的多功能化的高效、快速、樣品用量少的微型實驗室技術。Chip與分析儀器的微型化、集成化和便攜化緊密相連，符合現代化學、制藥工業的低成本和高產出的需求。

        在電子工業中，芯片一般采用晶體硅，但晶體硅對于Chip并不很合適，因此轉而采用石英玻璃、有機玻璃和硅橡膠作為基體材料。不同的材料，其制作方法不同。晶體硅和石英玻璃基體多采用微加工蝕刻法，有機玻璃采用注塑法、印模法和激光燒蝕法。Chip相對于傳統CE的主要優點是電滲流泵的擴展應用、良好的散熱性能和設計多樣性。

        每一種新興技術總是在發展的過程中存在著一些問題，有待解決，Chip也是如此。首先，它的芯片材質還在不斷的挑選和試用中，每一種材料都有各自的優缺點，需進一步的摸索和完善，盡快找到一些在技術上可行、價格上能接受的材料是當務之急。其次，Chip進樣常采用電動進樣，但檢測器常用LIFD。這樣的檢測器無法集成到芯片上，使得僅僅是進樣和分離集中化，而檢測卻還是常規尺度，導致芯片雖小，檢測器卻很大，這顯然不符合微型化的要求。因此，也可考慮使用電化學檢測器，實現真正的集成化。當然，對于痕量物質的檢測十分有效的質譜檢測器也是一個方向，同樣接口技術還是關鍵。再次，從單純、單一的成分分析檢測過渡到在線檢測、復雜樣品前處理和單分子、單細胞分析，也有很多工作要做。另外，市場開發階段和商品化階段也是當前所面臨的巨大挑戰。在產業化的同時，以期帶動基礎研究，為Chip的進一步發展打下堅實基礎。

三、毛細管電泳檢測技術的發展：

        CE的毛細管極細，分離效能很高，但同時對樣品組分的檢測帶來了困難，對檢測技術的要求較高。如何增加檢測器的靈敏度，又不造成明顯的區帶展寬，一直是CE技術發展中的一個至關重要的問題。迄今為止，已有許多檢測技術與CE聯用，在不同領域中發揮作用。

  1、紫外可見光吸收檢測：

        紫外可見光吸收是CE中應用zui廣泛的一種檢測方法。石英毛細管可透過20nm波長以下的紫外光，允許從紫外光到可見光的波長范圍內對樣品組分進行檢測。而且由于透光窗口直接開在毛細管上（柱上檢測），檢測器本身不存在死體積和因此而造成的組分區帶展寬現象。事實上樣品組分的分離在檢測窗口處仍在進行。為了獲得高效，檢測區的寬度應小于樣品組分的區帶寬度，也就是說透光窗口應足夠小。毛細管電泳峰寬一般為2～5mm，透光窗口的尺寸應控制在上述峰寬的1/3以內。紫外可見光吸收檢測的主要缺點是靈敏度不高，這主要是光程太短所致。

  2、熒光檢測：

        熒光檢測也是CE中一種常見的柱上檢測方法，因組分區帶小，不會引起額外展寬，而且檢測靈敏度很高。尤其是激光誘導熒光檢測（LIF），其靈敏度可高達10ˉ¹²～10ˉ¹⁶mol/L，是目前CE中zui靈敏的一種檢測方法。熒光檢測器的缺點是僅能用于有天然熒光和易于用熒光試劑標記或染色的物質的檢測，價格較高。但由于LIF的高靈敏度和高選擇性，仍是CE中不可缺少的檢測方法。

  3、電化學檢測：

        電化學檢測可避免光學類檢測器遇到的光程太短的問題，對電活性組分的檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、選擇性好和價格低等特點。安培檢測是三種電化學檢測模式（電導檢測、電位檢測和安培檢測）中zui易實現、應用較廣的一種檢測技術，為微體積環境中電活性物質的測定提供了高靈敏度的檢測方法。但安培檢測要求被檢測物質必須具有良好的電化學活性，因而檢測范圍有一定的局限性。

  4、質譜檢測：

        質譜檢測（MS）具有較強的定性功能，在一次分析中可獲得很多結構信息，將CE與MS相結合是分離科學中的一項突破性進展。

（1）CE－MS聯用的關鍵是接口。

（2）CE－MS聯用有著很強的生命力，但尚存在以下缺點：

    1）濃度靈敏度低，不如LC－MS。

    2）不是所有的CE分離模式都可方便地與MS聯用。

    3）MS對CE分離緩沖液的限制較多。

（3）CE－MS聯用有以下難點需進一步改善：

    1）如何將被分析物的分子或離子經由CE分離后的液態zui終傳至高真空的MS中。

    2）接口處的體積范圍怎樣才能與CE的峰體積兼容。

    3）分離電解質的成分怎樣才能與質譜的需求兼容。

    4）在聯機模式下如何將CE流出物以在線方式有效地傳到MS中而不丟失分離效率。

四、毛細管電泳的應用：

        CE具有高效、快速、靈敏和樣品消耗少等優點，具有極大的發展潛力，應用領域正在不斷擴展深入。

  1、手性化合物分離：

        大量研究表明，生命活動與生物分子的手性密切相關，構成生物體的基本物質如氨基酸都是L型，糖類化合物都是D型。在很多手性藥物中，其中一個映體具有明顯的藥理作用，另一個則可能低效或無效甚至可能有毒副作用。而CE特別適合手性化合物的分離和研究。

        CE手性分離一般通過添加手性選擇劑，在電泳液中提供一定的手性環境，根據對映體與選擇劑之間的相互作用不同達到分離。手性選擇劑有