高效液相色譜分析法和氣相色譜法的區別

  高效液相色譜法與氣相色譜法一樣，都屬于色譜法，具有：選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點。本文就兩種色譜法的應用范圍、儀器構造等不同點做出比較。

　　氣相與液相的概念

　　氣相

　　氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質各組分在不同兩相間分配系數(溶解度)的微小差異，當兩相作相對運動時，這些物質在兩相間進行反復多次的分配使原來只有微小的性質差異產生很大的效果而使不同組分得到分離。

　　液相

　　高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上引用了氣相色譜的理論。在技術上，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而,使柱效大大高于經典液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬);同時，柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進行連續檢測。

　　應用范圍

　　氣相

　　分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等。

　　受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析，一般對500℃以下不易揮發或受熱易分解的物質部分可采用衍生化法或裂解法。

　　液相

　　高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此，不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機物(些物質幾乎占有機物總數的75%～80%)。原則上，都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

　　氣相儀器構造

　　氣相

　　由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。

　　1.柱箱：

　　色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個組份在色譜柱中經過反復多次分配后得到分離，從而達到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由于色譜柱的兩端分別連接進樣器和檢測器，因此，進樣器和檢測器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細管柱并且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，采用微機對柱箱進行溫度控制，并且由于設計合理，柱箱內的梯度很小。

　　對于一些成份復雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進行三階程序升溫控制。且程序設定后自動運行無需人工干預，降溫時還能自動后開門排熱。

　　2.進樣器：

　　進樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進樣器還必須將其汽化。因此，采用微機對進樣器進行溫度控制。

　　根據不同種類的色譜柱及不同的進樣方式，共有五種進樣器可供選擇：

　　填充柱進樣器

　　毛細管不分流進樣器附件

　　毛細管分流進樣器附件

　　毛細管分流/不分流進樣器

　　六通閥氣體進樣器

　　3.檢測器：

　　檢測器的作用是將樣品的化學信號轉化為物理信號(電信號)。

　　檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，采用微機對檢測器進行溫度控制。

　　根據各種樣品的化學物理特性，共有五種檢測器可供選擇：

　　氫火焰離子化檢測器(FID);

　　熱導檢測器(TCD);

　　電子捕獲檢測器(ECD);

　　氮磷檢測器(NPD);

　　火焰光度檢測器(FPD);

　　4.數據處理系統：

　　該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

　　高效液相儀器構造

　　液相：

　　高效液相色譜儀主要有：進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。

　　1.進樣系統

　　一般采用：隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

　　2.輸液系統

　　該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4×107Pa流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值或改用。。。

　　3.分離系統

　　該系統包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。

　　色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)內徑為2～5mm，由優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成)，固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學法偶聯各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。

　　因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

　　另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小、微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。

　　這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60℃通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

　　4.檢測系統

　　高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：

　　(1)紫外檢測器

　　該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。

　　其特點：使用面廣(如，蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);靈敏度高(檢測下限為10^-10g/mL);線性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

　　(2)示差折光檢測器

　　凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測;糖類化合物的檢測使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但是，靈敏度低(檢測下限為10^-7g/mL)，流動相的變化會引起折光率的變化;因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

　　(3)熒光檢測器

　　凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如，多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等。。。)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10^-12～10^-14g/mL)痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。

　　5.數據處理系統

　　該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

　　高效液相色譜與氣相色譜法優點和不足分析

　　只有20%樣品可不經化學處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機化合物要用高效液相色譜分析。

　　氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性;另外，可作流動相的化合物多，選擇余地廣。

　　與氣相色譜相比，高效液相色譜儀的另一個優點是：樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集。回收是定量的，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質。

　　高效液相色譜不足的是，日前，檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應”對柱效率及色譜分離的影響。