高效液相色譜法測定紅霉素眼膏的含量的探討

　　紅霉素眼膏系由紅霉素和眼膏基質加工制成的外用抗菌素，是目前臨床常用于沙眼、結膜炎、角膜炎、眼臉緣炎及眼外部感染。中國藥典2000年版采用抗生素微生物檢定法測定其含量，該方法周期長，操作繁瑣，影響因素較多。本文介紹的高效液相色譜法，采用優化的色譜條件，使紅霉素眼膏的含量測定操作簡便，專屬性高，重現性好，可以替代微生物檢定法。

　　1儀器與試藥

　　AgilentLC1100高效液相色譜儀，AgilentLC1100自動進器，AgilentLC1100紫外檢測器，依利特色譜柱（大連依利特科學儀器有限公司，填料：sinochromODS-BP5um；4.6mm×250mm），AgilentLC1100數據處理儀。

　　紅霉素對照品由中國藥品生物制品檢定所（批號：0307－9713）；紅霉素眼膏三批（批號041103、050202、050601），規格2g：0.5%；眼膏基質均由新鄉恒久遠藥業有限公司提供；乙腈為色譜純；磷酸二氫銨、三乙胺為分析純；水為超純水。

　　2方法與結果

　　2.1色譜條件固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：0.1mol/L磷酸二氫銨溶液（三乙胺調節pH6.5）-乙腈（70：30）；流速1.0ml/min；檢測波長210nm；進樣量20ul。在上述條件下，測得紅霉素對照品溶液色譜圖，紅霉素的保留時間約為6.3分鐘，與雜質峰的分離度均大于1.5。

　　2.2對照品溶液的制備精密稱取紅霉素對照品320mg，置50ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成對照品貯備液，再精密量取2ml置25ml量瓶中，加流動相配制成每1ml含紅霉素0.5mg的對照品溶液。

　　2.3供試品溶液的制備精密稱取樣品10g，置分液漏斗中，加石油醚80ml，緩緩振搖，使基質溶解，用磷酸鹽緩沖液（pH6.5）提取4次，每次約25ml，合并提取液，置100ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH6.5）稀釋至刻度，搖勻，配制成每1ml含紅霉素0.5mg的供試品溶液。

　　2.4線性關系分別精密量取上述對照品貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0ml至25ml量瓶中，加流動相至刻度。分別進樣20ul，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對進樣量（X）繪制標準曲線，回歸方程為：Y=32798+95934Xr=0.9999。結果表明，紅霉素在進樣量2.5～80ug的范圍內，峰面積與進樣量之間呈良好的線性關系。

　　2.5陰性對照溶液試驗按處方（除紅霉素外）配制陰性樣品，照“2.3”項下操作，即得空白溶液，在上述色譜條件下，進樣20ul。記錄色譜圖，見圖1。

　　2.6精密度試驗取試驗用對照品溶液,重復進樣5次，記錄色譜峰面積，RSD為0.55%。

　　2.7溶液穩定性取試驗用供試品溶液在室溫放置，分別于0、1、3、5小時取20ul進樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.13%。

　　2.8回收率試驗分別稱取按處方比例的基質約4.95g，稱取9份，分別精密加入紅霉素對準品40mg，50mg，60mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定，計算回收率。

　　2.9樣品測定取樣品3批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液；另精密稱取紅霉素對照品適量，按“2.2”項下方法制備對照品溶液；精密量取對照品和供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算出供試品中紅霉素的含量，并與中國藥典2000年版收載的微生物檢定法進行比較，結果見表2。

　　3討論

　　3.1檢測波長的選擇:取紅霉素對照品用流動相溶解并制成每1ml中含0.5mg的溶液，在190nm～300nm的波長范圍內掃描，在210nm的波長處有最大吸收，因此選擇210nm為檢測波長。

　　3.2流動相的選擇:在實驗過程中，選擇不同鹽濃度和不同pH值的流動相進行比較，發現鹽濃度的增加可改善紅霉素與有關物質的分離度，流動相pH值的提高也可改善紅霉素與有關物質的分離度，考慮到對色譜柱的損耗，故選用0.1mol/L磷酸二氫銨溶液（三乙胺調節pH6.5）?乙腈（70：30）作為流動相。

　　3.3用HPLC法測定紅霉素的含量，準確性及重現性均較好，且操作簡便，HPLC法與微生物檢定法進行比較，測定結果基本一致（見表2），因此可以用HPLC法替代微生物檢定法測定紅霉素含量。