2方法
2.1造模與分組大鼠單籠飼養,將大鼠隨機分為空白組、模型組、膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥物組,共6組,每組8只。其中低、中、高劑量組分別按0．75、1．5、3g·kg-1·d-1給予灌胃,DZP組給予1．0mg·kg-1·d-1灌胃,空白組和模型組灌服等容積的生理鹽水,連續7d灌胃給藥,d5、6、7除空白組外,其他各組在給予藥物后進行急性應激造模。于d5各組灌胃后,參照文獻[12]造模方法并對其進行相應改進,除空白對照組外的其余各組動物放進束縛裝置,束縛管只限制大鼠的活動范圍,對其呼吸并無抑制。束縛期間禁食禁水,束縛結束后恢復自由。每次刺激30min,每日1次,連續3d。d7給藥束縛后,進行高架十字迷宮測試。
2.2對急性應激大鼠高架十字迷宮行為的影響迷宮測試前,將每只大鼠放入一個1125px×750px×375px塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM的中央平臺處,使其頭部正對其中一個開放臂,采用紅外線技術記錄5min內大鼠的活動情況。每次測試完成后,用紙巾清除糞便,隨后濕布蘸取酒精擦拭迷宮,繼而用干布擦凈后再進行下一只大鼠的測試。記錄5min內動物進入開臂次數(openarmentry,OE)、閉臂次數(closearmentry,CE)及迷宮中央區內的次數及在開臂與閉臂內的運動時間。以進入開臂次數與總入臂次數的百分比(thepercentageofentriestotheopenarms,OE%)及在開臂內運動時間與開臂閉臂內的總時間的百分比(thepercentage oftimespentintheopenarms,OT%)代表抗焦慮作用指標。
2.3Westernblot檢測急性應激大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號通路和BDNF的表達
2.3.1取材大鼠急性應激EPM實驗結束后,立即斷頭處死,迅速取出大腦,于冰盤上快速分離出海馬及皮層,隨后于-80℃低溫冰箱中凍存待用。
2.3.2組織裂解取約200mg海馬或皮層組織,加入預冷的RIPA裂解緩沖液冰浴超聲3×4s,4℃下12000r·min-1離心10min后吸取上清,采用Bradford法測定蛋白濃度后分裝,立即95℃煮10min使蛋白變性,防止蛋白降解,煮后的蛋白可-20℃保存備用。
2.3.3Westernblot測定按Westernblot方法測定p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白與內參蛋白β-actin的表達,目的蛋白表達量與內參蛋白表達量的比值作為組織內蛋白的相對表達水平。Westernblot具體操作步驟如下:灌膠與上樣:配制12%分離膠,加水封膠。分離膠凝固后將水盡量倒干凈,用濾紙吸干分離膠殘留的水,配制5%的濃縮膠,灌入制膠板,插入樣品梳。待到濃縮膠凝固后,取出樣品梳。加入50μg蛋白的上樣樣品至1．5mL離心管中,加入5×loadingbuffer上樣緩沖液至終濃度為1×,加足量的runningbuffer后上樣。
電泳:110V電壓恒壓電泳2h,電泳至溴酚蘭即將跑出,即可終止電泳,停止電泳,拆開膠板,棄去濃縮膠,取出分離膠。
轉膜操作:將PVDF膜在無水甲醇中浸泡至膜變成灰色透明,馬上取出,放入去離子水中浸泡2min,隨即放入預冷的1×轉膜Buffer中浸泡,浸泡凝膠30min,濾紙、海綿20min,以1×轉膜Buffer注滿電轉膜槽,接通電泳儀,以0．23mA電流恒流轉膜1h。
免疫反應:將膜用TBST從下向上浸濕后,移至含有封閉液的保鮮盒中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1h后,4℃冰箱封閉過夜。將p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB、CREB與β-actin蛋白抗體以1×TBST稀釋(1∶1000),將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,4℃冰箱中孵育過夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min。同上方法二抗結合(1∶8000),室溫下孵育1h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min,隨后進行化學發光反應。
化學發光、顯影、定影:取ECL發光工作液A和B兩種試劑各500μL混合后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1min,將膜用保鮮膜包好后移至X光壓片夾后,進入暗室曝光X片。曝光結束后,放入顯影液中顯影并定影,自來水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。
凝膠圖像分析:將膠片進行掃描拍照,用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。
2.4統計學處理使用SPSS16．0軟件對數據進行統計,計量數據使用x■±s表示。多組間比較采用(One-wayANOVA)單因素方差分析,兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗法,方差不齊時采用Dunnett’sT3進行兩兩比較。
4討論
束縛應激是一種有效的焦慮應激模型,通過數次強度、時間一致的束縛之后,可誘發動物出現排尿排便增多、修飾行為明顯增多等行為指標,同時,還會影響體內激素及內分泌系統的變化,這些生理反應正是焦慮患者體內的生理變化。
生物學研究認為,調節正常和病理性焦慮狀態的神經生物學通路異常是導致焦慮障礙的原因。而海馬和皮層中ERK-CERB信號通路被認為可能與焦慮有關。研究表明,焦慮大鼠腦內p-ERK1/2含量明顯增加,且PD98059阻斷其磷酸化后,可產生明顯抗焦慮的作用。Meller等發現,急慢性束縛應激可引起大鼠海馬中p-ERK1/2的不同變化,大鼠急性束縛30min后,海馬中p-ERK1/2含量明顯增加,慢性束縛應激11d后,海馬中p-ERK1/2含量明顯減少。CREB轉錄因子的基因表達和對緊張、焦慮的潛在作用也被廣泛研究,Lu等研究表明,28d慢性應激大鼠海馬中p-ERK1/2與p-CREB的含量均明顯減少。然而,也有研究表明14d壓力誘導大鼠海馬中的p-ERK1/2與p-CREB的含量均升高。通過以上結果可以發現,不同時間應激對p-ERK1/2與p-CREB的含量調控是雙向的。本實驗對大鼠采用3d急性束縛應激,束縛大鼠表現為易受驚嚇、易激惹、被毛豎立;束縛組大鼠在高架十字迷宮模型中表現為排尿、排便次數增多,呈現焦慮狀,且與空白組相比,開臂時間與次數百分比明顯減少,提示3d造模可使大鼠產生焦慮。
因此,本實驗對大鼠海馬和皮層中p-ERK1/2與p-CREB的含量進行測定,以明確復方抗焦慮膠囊對3d急性束縛應激模型大鼠ERK-CERB信號通路的調節方式。實驗結果表明,束縛應激會增強ERK-CREB通路的活化,導致磷酸化ERK和磷酸化CREB含量的增加,而地西泮和復方抗焦慮膠囊會抑制ERK-CREB過度的磷酸化,提示復方抗焦慮膠囊可能通過影響ERK-CREB信號通路產生抗焦慮作用。
BDNF是最早發現的神經營養因子,自1989年其cDNA結構被闡明以來,對BDNF的分布及功能有了廣泛的深入研究。研究發現,BDNF可以調節神經元和突觸的可塑性,對中樞神經元的增殖和修護有巨大的意義,而焦慮癥的治療也與神經元和突觸的形成有密切關系。本實驗結果表明,應激模型導致大鼠皮層及海馬中BDNF明顯減少,而復方抗焦慮膠囊可以明顯抵消這種減少,從而對皮層和海馬產生保護作用。
ERK-CREB通路與BDNF蛋白的表達關系密切,ERK-CREB通路的變化可以影響BDNF蛋白的表達。BDNF蛋白參與急性焦慮信號。實驗結果表明,復方抗焦慮膠囊對ERK-CREB通路和BDNF蛋白的表達都有明顯的影響,表現為抑制ERK-CREB通路的磷酸化與增加BDNF的表達,因此提示膠囊可能通過調節它們的相互反應而發揮其抗焦慮作用。
綜上所述,本實驗結果表明復方抗焦慮膠囊對急性應激模型大鼠具有一定的抗焦慮作用,并且其作用機制可能與影響ERK-CREB信號通路及BDNF的表達有關系,但它們之間深層次的相互影響有待于進一步研究。