高耐慶大霉素腸球菌耐藥性接合轉移試驗的方法探討1

腸球菌是醫院感染的重要病原菌 [1] ，對多種抗菌藥產生耐藥性，而且耐藥菌株不斷增加，接合轉移是導致腸球菌慶大霉素等耐藥基因轉移、耐藥性播散的重要原因，深入研究接合轉移試驗有助于了解腸球菌耐藥性的產生機理。我們研究了不同培養基和不同轉移方法對腸球菌質粒轉移試驗結果的影響，并對接合前后菌株的耐藥性進行了分析。

材料與方法

一、材料

1 ．菌株

(1) 供體菌 36 株高耐慶大霉素 (HLGR) 糞腸球菌， 15 株 HLGR 屎腸球菌， 1 株耐萬古霉素 (VER) 糞腸球菌均來自北京友誼醫院的臨床標本，所有菌株利福平 MIC 值均小于 32 μ g ／ ml 。

(2) 受體菌 糞腸球菌 JH2-2 ( 由 Don B ． Clewell 贈送，利福平 MIC>50 μ g ／ ml ，對慶大霉素、鏈霉素、青霉素、萬古霉素、氨芐西林、四環素、紅霉素、氯霉素敏感 ) ；本實驗室分離的金黃色葡萄球菌 S1106( 四環素 MIC128 μ g ／ m1) 、表皮葡萄球菌 S368( 利福平 MIC64 μ g ／ ml) 。

(3) 質控菌株 糞腸球菌 ATCC29212 、 ATCC51299 。

2 ．抗菌藥 慶大霉素 (Gm) 、鏈霉素 (Sm) 、青霉素（ Pen ）、利福平 (Rif) 、萬古霉素 (Van) 、氨芐西林 (Amp) 、四環素 (Tet) 、紅霉素 (Ery) 、氯霉素 (Chl) 等標準品購自中國生物藥品檢定所。

3 ．培養基

(1) 普通肉湯 (NB) 牛肉粉 10g 、牛肉胨 10g 、 K 2 HPO 4 · 3H 2 O 0.58g 、 NaCl 5g ，加水至 1000ml ，高壓滅菌備用。

(2) 心腦浸液粉 (BHI) 購自 BBL 公司。

4. BHI 選擇培養基 Gm ／ Rif 選擇培養基①： Gm500 μ g ／ ml ， Rif50 μ g ／ ml ； Gm ／ Rif 選擇培養基②： Gm500 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ ml ； Gm ／ Tet 選擇培養基： Gm500 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 選擇培養基①： Van64 μ g ／ m1 ， Rif50 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 選擇培養基②： Van64 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ m1 ； Van ／ Tet 選擇培養基 ： Van64 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml 。

5. PCR 相關試劑購自賽百盛公司、天為時代公司。 PCR 儀為美國 Biotronic 公司 AG-9600 型擴增儀。

6 ． Vitek — AMs 全自動微生物系統 (bioMerieux Vitek ， Inc ． ) 。

二、方法

1 ．菌株鑒定及藥敏試驗全部試驗菌株經 Vitek 全自動微生物系統鑒定，藥敏試驗按照 NCCLS 推薦 Kirby-Bauer 法進行，采用 2002 年 NCCLS 推薦瓊脂稀釋法，進行高耐慶大霉素 (MIC>500 μ g ／ m1) 、高耐鏈霉素 (MIC>2000 μ g ／ m1) 、耐萬古霉素 (MIC>6 μ g ／ m1) 的確證，以及利福平的 MIC 測定。

2 ．質粒接合轉移試驗

(1) 肉湯接合法 按參考文獻 [2] ，進行，將活化后的保存菌株用生理鹽水調制濁度為麥氏管 0.5 號，取 5 μ l 菌液于 1m 1 中不同的液體培養基：普通肉湯 (NB) 、普通肉湯加馬血清 (NBH) 、心腦浸液 (BHl) 、 BHI 加馬血清 (NBH) 。 35 ℃ 培養 4h ，取供體菌及受體菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，加入到 2ml 相對應的液體培養基中， 35 ℃ 振蕩培養 4h ，離心后取少量沉淀培養物轉種于含抗菌藥物的 BHI 選擇培養基， 48h 觀察結果，有菌落生長者即為接合轉移成功。

(2) 濾膜接合法 按參考文獻 [3] 進行，將活化后的保存菌株用生理鹽水調制濁度為麥氏管 0.5 號，取 5 μ l 菌液于 lml 中液體培養基 35 ℃ 培養 4h ，取供體菌及受體菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，直接涂布于滅菌的無菌濾膜 ( 孔徑 0.22 μ m) ，將濾膜置于 BHI 平板中， 35 ℃ 培養過夜，用 1mlBHI 肉湯沖洗濾膜，將沖洗液轉種于 BHI 選擇培養基， 48h 觀察結果，有菌落生長者即為接合轉移成功。

3 ．質粒 DNA 的提取：采用堿性裂解法 [4] ，裂解液 I 中不必加入溶菌酶，加入Ⅱ液后靜置時間延長至 7 ～ 10min 。

4. PCR 法檢測耐藥基因 檢測雙功能酶基因 aac( 6' )-apb( 2 ” ) 的引物 [5] 為 5' -TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT — 3' 和 5' — CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT -3' 。 20 μ l PCR 反應體系，擴增條件：預變性 94 ℃ 5min ，變性 94 ℃ 30s ，退火 52 ℃ 30s ，延伸 72 ℃ 60s ， 30 個循環，分別以 ATCC51299 和 ATCC29212 作為陽性和陰性對照。

結 果

1 ．糞腸球菌標準菌株 ATCC51299 、 ATCC29212 質控結果見表 1 。

表 1 糞腸球菌標準菌株在 8 種抗生素培養基上的生長結果

注：“ + ”有菌落生長，“—”無生長。

2 ．質粒接合轉移試驗結果

(1)36 株糞場球菌耐藥質粒液體接合轉移和濾膜接合轉移試驗的結果見表 2 。

表 2 36 株糞腸球菌質粒接合轉移結果

注：普通肉湯（ NB ）、普通內湯加馬血清（ NBH ）、心腦浸液（ BHI ）、 BHI 加馬血清（ BHIH ）

(2) 使用 BHI 肉湯作為培養反應介質， 15 株 HLCR 屎腸球菌中無一株將 HLGR 耐藥性轉移至 JH2 — 2 。但通過濾膜接合法，有 14 株轉移成功。

(3) 使用 BHI 培養反應介質， VRE 腸球菌將對萬古霉素耐藥性轉移至 JH2 — 2 。

(4) 肉湯接合法、濾膜接合法均未能將 HLGR 、 VRE 的耐藥性從腸球菌屬轉移至金黃色葡萄球菌 S1106 、表皮葡萄球菌 S368 。

3 ． HLGR 糞腸球菌的供體菌與結合子藥敏試驗結果見表 3 ，表 4 。 36 株糞腸球菌均對 3 種以上抗菌藥耐藥， 36 ％ (13 ／ 36) 和 47 ％ (17 ／ 36) 的菌株對 4 種和 5 種以上抗菌藥耐藥。