高通量測序技術

沒有測序的癌癥診斷是不完整的，完整的癌癥診斷應該包括一系列基于細胞遺傳學技術、熒光原位雜交技術、標準分子技術以及NGS的預后與預測性分析。對于早期癌癥患者來說，NGS序列分析在多種癌癥的篩查技術中具有不容忽視的代表性;而對于晚期癌癥患者，大量的侵入性測試往往只能篩查出少數幾個藥物靶點。
隨著技術的進步與價格的下調，NGS綜合分析技術越來越多地在臨床腫瘤篩查中得到了推廣(諸如NCI MATCH項目)，綜合基因組分析技術引起了人們對腫瘤全基因組與全外顯子組測序的熱情。同時，全基因組測序日益發展成為神經疾病診斷的一線工具。
另一方面，生物信息學的發展滯后使得測序技術迅猛發展的后繼需要難以滿足，高通量測序數據的處理面臨著兩個巨大的挑戰，即腫瘤樣本全基因組突變評估與DTC(direct-to-consumer )市場遺傳學研究結果不一致。

一、腫瘤樣本全基因組突變評估

Alioto和他的同事們對國際癌癥基因組聯盟中八家實驗室的成神經管細胞瘤樣本HiSeq全基因組測序結果進行了對比，最初的對比結果顯示不同實驗室的樣本預處理方式(是否選擇PCR對樣本DNA進行擴展)對測序深度以及覆蓋率有著極大影響，其中兩家樣本DNA濃度沒有達到平均測序深度最小要求實驗室的數據得到了剔除。即使在剩下的六家實驗室中，全基因組測序的覆蓋深度范圍也從50%-75%不等，這樣的結果嚴重限制了后期的突變識別。

在生物信息學方面，共有18家實驗室向國際癌癥基因組聯盟提交了體細胞單堿基突變分析，16家實驗室提交了插入或缺失結果。雖然國際癌癥基因組聯盟擁有與之相關的黃金標準，但其標準仍然只能夠涵蓋所有實驗室不到四分之一的體細胞單堿基突變與347個插入或缺失中的1個。

測序結果的分析主要有以下四個特點：

1.染色體上均衡分布的突變絕大多數為真陽性，少數為假陽性；
2.均衡分布的突變中具有許多假陰性位點；
3.假陽性簇臨近著絲粒；
4.聚集突變具有較高的假陽性率。

相關的研究結果證明測序工具的選擇對突變位點的精確辨析有著巨大的影響。同時，腫瘤細胞的相對含量對于突變位點的精確辨析也有著巨大的影響。即使是對經驗豐富的實驗室來說，全基因組測序突變篩查仍然是一項容易出錯的工作，全基因組和全外顯子測序離臨床實驗室的應用標準還有著一定的距離，相關臨床工具的開發工作應該在相關機構的指導下得到有效開展。

為此，Alioto和他的同事們對測序事業的相關工作者提出了以下幾點要求：
1.進行全基因組測序前避免對基因組進行PCR擴展，防止擴增引起的錯誤;
2.腫瘤樣本的測序覆蓋深度應高于100X;
3.生殖細胞系基因組測序深度應與其他類型腫瘤一致;
4.結合使用多種定位與多樣的篩查軟件;
5.應用多種突變篩查技術;
6.對重復序列中的突變進行修正;
7.根據序列質量、制圖效果以及鏈偏好性對序列進行過濾處理，同時使用參照基因組對序列質量進行有效控制。

二、DTC市場中存在的遺傳學研究結果不一致
對比顯示，DTC測序產品的檢測結果往往更加具有挑撥性。Corpas等人將一個西班牙家庭一家四口(爸爸媽媽，兒子女兒)的樣本分別送至四家DTC測序公司進行全基因組分析，他們發現這四家公司的測序報告在至少一位家庭成員中存在明顯的差異。即使是與樣本最匹配的部分，四家公司的測序結果中仍鮮有重疊。四家公司中的三家報道了三位或四位家庭成員存在多個變異，而另一家公司報道僅僅一位家庭成員基因組發生變異。

這項研究說明DTC測序公司的全基因組測序服務往往有著大相徑庭的結果，有效反映了目前行業對于測序與數據分析標準的缺失，不同測序機構難以產出一致且有效的報告。"消遣性測序"的準確性應該受到質疑，相關的循證研究對于行業的可持續發展具有積極意義。