高通量測序鎖定病原體“命門”

《科學》雜志的歷史上，刊載過一篇沉重的學術文章。2014年一篇關于通過基因組學手段監測埃博拉病毒的起源和傳播的論文，在刊登時已有6名研究人員因感染埃博拉而死亡。

“對埃博拉病毒的研究和控制是高通量測序技術（二代測序技術）全面應用的首次‘實戰’。”日前，在由中國醫學科學院、北京協和醫學院主辦的第二屆感染性疾病精準醫學高峰論壇上，參加過與埃博拉病毒一線作戰的研究人員，對中國團隊與埃博拉病毒“作戰”的戰略戰術進行了揭秘。中國科學院武漢病毒研究所研究員劉翟表示，病原體能使人類群體性致病甚至致死，二代測序技術及宏基因組學能幫助人類追溯病原體、捕捉放大它們在分子水平上的變化、鎖定病原體“命門”，最終贏得“人毒之戰”“人菌之戰”。

測準遺傳物質 新策略抓住病毒“七寸”

在2014西非埃博拉病毒爆發期間，美國的團隊最初斷言病毒可能在加速進化。劉翟回憶，這一發現在當時是一個“面臨強敵”的信號，它意味著傳統的檢測防治方法或許失效，如果埃博拉病毒是迅速變化且致命性疊加的致病原，其危險性將比人類最初認知的更高。

“病毒在短時間內迅速變化并不符合進化邏輯。”劉翟說，要改變美國團隊的結論，中國團隊需要提供更多的事實和數據。

中國團隊在非期間檢測了大量臨床樣本，對175株埃博拉病毒進行了全基因組測序。“利用二代測序技術，很少的變異也能被‘覺察’到。”劉翟說。

二代測序的應用不是簡單地將病例樣本中的基因提取出來進行比對。全基因組的遺傳信息繁雜而海量，測定不只包括量的疊加，還包括相互作用和影響，即測定病毒在宿主體內的進化，以體現宿主和病毒的基因組之間的相互作用與關聯。宏基因組學的研究基礎是人和病毒的遺傳物質混在“一個籃子里”，這增加了研究工作難度；此外，由于埃博拉病毒是RNA病毒，共同提取的將是人類遺傳物質中的RNA，RNA的復雜程度也加大了研究難度……

為此，研究團隊設計開發了埃博拉病毒基因組的新測序策略——擴增子深度測序技術，并開發了一套全新的生物信息學分析流程。“我們設計了標準質粒進行方法驗證，將測序方法的假陽性率控制在千分之一以下。”劉翟介紹，考慮到在宿主中病毒的痕量，團隊還在方法的敏感性上取得了突破，做到低濃度樣本下仍能探測到位點變化。

團隊對于樣本的生物信息學分析，在病毒暴發過程中第一次鎖定了埃博拉病毒的“進攻線路圖”。劉翟展示的病毒地理學聯絡圖，顯示與西非的城市熱度和交通樞紐相一致。

除了進攻路線，團隊還揭示了埃博拉病毒基于自身的“戰術變化”——在宿主內，埃博拉病毒曾經產生了710個單核苷酸變異位點，也維持著最保守基因的不變。保守基因的發現相當于抓到了病毒的“七寸”。劉翟逆向思維，“最保守基因的突變對于病毒大都有害，可以作為最有效的抗病毒靶點。”

預判威脅 防患SARS“東山再起”

同類技術在SARS（嚴重急性呼吸綜合征）同族病毒的發現與監控中，也發揮了居功至偉的作用。

幾年前，廣東省四個豬場出現了小豬仔急性腹瀉死亡的疫情，兩萬多頭小豬出生后6天之內迅速死亡。這引起了軍事醫學科學院研究員童貽剛的注意，“近年來發生的重大傳染病疫情大部分由動物病毒跨種傳播引起，此次疫情發生地距離SARS發源地小于100公里。我們通過遺傳物質的測序確定致病病毒也是一類冠狀病毒。”病毒類型、發生地點以及近年規律都不同程度地亮起“警報”。

《變形金剛》里的威震天被消滅多次，卻會在宇宙的盡頭休整，一旦人們放松就伺機重生。SARS冠狀病毒在2003年造成了全球性的恐慌之后，會不會上演威震天的戲碼？

為了回答新發現病毒與SARS病毒同源性如何、如何傳播、感染人類能力等問題，多個科研機構組成的團隊共同展開研究，基于二代測序技術進行病毒分離鑒定、動物感染回歸實驗、回顧性檢測等工作。團隊將新病毒命名為豬急性腹瀉綜合征（SADS）冠狀病毒。

“通過新舊病毒的比對，我們發現它與SARS病毒在外殼蛋白上有86%的相似度。”童貽剛說，這說明感染蛋白可能發生了變化。也就是說，病毒獲準進入機體完成感染的“敲門磚”變了。

隨后，科研團隊用已確定的病毒特征為“釣餌”，在廣東地區近幾年收集的蝙蝠標本中，尋找是否有蝙蝠攜帶關聯病毒。在幾百個樣本中，團隊獲得了58份結果為陽性的樣本，大部分來自中華菊頭蝠（注：科學家們此前證實SARS病毒正是來源于中華菊頭蝠）。團隊進行了病毒傳播路線圖的繪制，發現發病的4個豬場并沒有相互傳染，很有可能是通過蝙蝠的糞便傳播。

“我們對豬場的飼養員進行了病原體檢測，沒有發現人員感染。”童貽剛說，但是對于病毒組學的研究表明，該類病毒是有能力感染人類的。病毒對人體的作用，以及激發人體內的免疫反應和對病毒表達的調控，仍是一個嚴峻課題，有待探索。

初入臨床 顛覆對罕見菌致病性認識

除了在威脅全球的重大傳染病疫情的防控中發揮重要作用，二代測序技術在日常臨床中的應用將有助于“認新”“控藥”“測毒”等，即診斷新型病原體、確定病毒的抗藥性以防止抗生素濫用、測定不同流行病的源頭等。

“近一年僅我們團隊在診斷病歷中就發現8例諾卡氏菌病例。而在教科書中，這類菌被描述為罕見菌。”復旦大學附屬中山醫院感染病科主任胡必杰教授說，過往資料表明，人類對這種菌的致病性認識非常有限。

胡必杰認為，現實與教科書中的反差是由于此前的手段難以幫助醫生診斷出這種致病菌。“它非常細小，在同樣的培養條件下，很難被分離出來，而且需要7天才會培養到可見。普通培養一般3天。”胡必杰說，菌體的“個性”使得憑經驗在病例中發現它相對困難。

二代測序技術讓它們重新回到醫生的診斷“視野”。胡必杰表示，通過對宏基因組進行測序，可無差別地檢測各種病原體，突破了傳統檢測手段的限制，大大提高了病原學檢出的敏感性，這種之前難以被檢出的病原體也“露了餡”。24小時內診斷也能為急性感染的判斷和對癥迅速給出參考。

由于設備要求高、技術門檻高、平臺構建需要大量資金投入，目前在臨床應用領域，二代測序只是“初入”，只有條件好、資金充足的少量三甲醫院在建相關平臺、培養和儲備技術人員。此外，不同樣本的提取如何才能高效準確、遺傳物質的提取質量標準如何，都尚待完善。中國食品藥品檢定研究院的雙盲測試表明，對于同樣的已知基因，不同測序公司的結果也并非完全一致。

中國工程院副院長、中國醫學科學院、北京協和醫學院院校長王辰院士呼吁：感染性（傳染性）疾病危害嚴重，精準診斷是實現其精準防控的前提。針對感染這一重大醫學問題，需要將基因檢測與傳統檢測相結合，加快將最新的生物科技轉化成先進生產力，應用于臨床感染精準診療。