將純化定量的水稻品種(93-11)基因組DNA標準樣品(0.5~8 ng)與1.0 μL本方法制備的水稻品種(02428)基因組DNA混合作為模板，用InDel 標記引物(表1)進行PCR擴增和PAGE檢測。箭頭指某反應(或2個反應之間)其02428與93-11條帶的信號值大致相等(即DNA等量點)，表明02428基因組DNA量與相應的標準DNA相當。
Different amounts (0.5–8 ng) of standard genomic DNA from a rice variety (93-11) were mixed with 1 μL genomic DNA from another variety (02428), and used as the template for PCR with primers (Table 1) of an InDel marker. Arrows show the band intensities in the reactions (or between two reactions) of 02428 and 93-11 were similar, indicating that the amounts of 02428 gDNA were about the same as those of indicated standards.
表1 本研究所用的PCR引物
Table 1 Primers used in this study
引物編號 Primer No. | 序列 Sequence (5’–3’) | 對應的圖 Corresponding Figure |
1 | TGTGTGCTTTCGCTGAAGAGA; TGTGCTCAGCCATAGGGTGTGTT | 圖1 Figure 1 |
2 | CGACATGTTGGCTATAAGG; ACCGGCCAATATTCCTTTG | 圖2-A~C, E,F Figure 2 A–C, E,F |
3 | ATGGTACTACACACGTTTGT; GAAACTCATACCTTACTTCA | 圖2-D (左) Figure 2 D (left) |
4 | TGCTCATCCTGCAGCTTCTTC; CGATCGGTTATTAACTCTTCCAT | 圖2-D (右) Figure 2 D (right) |
5 | GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG | 圖2-G (上) Figure 2 G (up) |
6 | GAGGTAGAAACCCACCCTAAA; CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG | 圖2-G (下) Figure 2 G (down) |
7 | CCCTTACGTGCAGTACATTG; ATGCAGGCTACTTACTAGCG | 圖3-A Figure 3 A |
8 | TCCTCCCTCTGTACCATTTG; ACGCCAAGAAAGTCATATGG | 圖3-B Figure 3 B |
9 | TCAACCAGTGAAGGGTCGACG; CTCAGTTGTCACGATGTGAACG | 圖3-C (M1) Figure 3 C (M1) |
10 | GCGGTTGTGAAAGGCTAATCC; AAGCAGCAGGAAATGGGAGTG | 圖3-C (M2) Figure 3 C (M2) |
2.2 加入不同量模板DNA的PCR效果
在一定量溶液中放入過多此方法制備的gDNA會帶入過量的雜質，因而會抑制PCR反應。我們的結果顯示，用2~3 mg葉片(150 μL)制備的模板(加入1 μL)的PCR效果(擴增830 bp)比用10~12 mg(150 μL)制備的模板的擴增效果要好(圖2-A, B)。進一步檢測加入不同容量gDNA(用3 mg葉片150 μL-1溶液制備)的PCR效果表明，20 μL PCR反應中加入上述方法制備的DNA 0.5~1.0 μL的擴增效果比加入2 μL的效果好；加入1 μL DNA和1 μL TE(含有1 mmol L-1 EDTA)的擴增效果更差。說明即使控制好合適的葉片量和溶液的比例，加入過量DNA溶液也因帶入過多的雜質和EDTA(制備液含有EDTA)而抑制PCR反應。因此，本方法的關鍵是要控制適合的葉片量和溶液的比例，同時加入的DNA溶液量不要超過PCR反應液的1/10。事實上，使用少至0.1~0.2 μL的模板DNA(約0.2~0.4 ng)就足以產生良好的PCR擴增效果(圖2-D)，說明模板DNA量(指低量)不是一個限制性因素。雖然將較高濃度的DNA(放入較多的葉片量)稀釋使用也可避免抑制PCR，但從操作的簡單化和效率化考慮，最好直接確定一個合適的葉片量與溶液比例范圍，以減少操作步驟。在實際操作中只摘取1段長度與96孔板深度相當的幼葉放入各孔中，由于只有下端約8 mm以下部分才能被合金珠打碎，因此不會產生葉片量與溶液比例過高的問題。用本方法也可從干燥葉片制備模板DNA做PCR(同樣要注意控制投入的葉片量不能過多，圖3-E, F)，適合于對野外采集和干燥保存的植物樣本的檢測。用本方法從其他植物制備的基因組DNA(如擬南芥，圖2-G)做PCR也產生良好的效果。
圖2 用本方法制備的植物gDNA的PCR擴增效果
Fig. 2 PCR effects using the prepared gDNA templates
A, B: 分別從約2~3 mg水稻苗鮮葉片150 μL-1緩沖液和約10 mg水稻苗鮮葉片150 μL-1緩沖液制備的DNA，取1.0 μL gDNA為模板進行PCR擴增。 C: 從3 mg水稻苗葉片 150 μL-1緩沖液制備的gDNA取不同量為模板進行PCR(20 μL反應)。D: 用遞減的不同量gDNA (2~3 mg水稻苗鮮葉片150 ?μL-1緩沖液) 進行PCR標記(InDel)的擴增。E, F: 分別從2~3 mg水稻干燥葉片150 μL-1緩沖液和約10 mg水稻干燥葉片150 μL-1緩沖液制備的DNA，取1.0 μL為模板進行PCR擴增。 G: 從約2~3 mg擬南芥鮮葉片150 μL-1緩沖液制備gDNA，取1.0 μL為模板進行PCR擴增。A~C, E~G反應為20 μL PCR反應，含有0.8 U Taq酶。PCR條件為95℃ 2 min, 33 循環的94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min。D的PCR條件與圖3相同。
A, B: PCR using 1.0? ?μL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of seedling leaf tissue in 150 μL preparation buffer, respectively. C: Using different volumes of rice gDNA prepared from 3 mg seedling leaf tissue in 150 μL preparation buffer as PCR template. D: Use of decreased amounts of gDNA (from 2–3 mg seedling leaf in 150 μL preparation buffer) for performing PCR with InDel markers. E, F: PCR using 1.0 μL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of dried leaf tissue in 150 μL preparation buffer, respectively. G: PCR using 1.0 μL Arabidopsis thaliana gDNA prepared from 2–3 mg fresh leaf tissue in 150 μL preparation buffer. A–C, E–G were conducted in 20 μL PCRs containing 0.8 U Taq, with thermal conditions of 95℃ 2 min, 33 cycles of 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min. PCR setting and thermal conditions in D were the same as those in Fig. 3.