玄參屬于玄參科，藥用玄參主要采取玄參的干燥根進行炮制。玄參在我國是非常常用的道地藥材，具有清熱解毒、涼血泄火、滋陰補腎的作用。在臨床上多用于治療盜汗、便秘、喉嚨腫痛、吐血、咳血、熱病、煩躁、口渴、疥瘡等[1]。高效逆流色譜技術是一種新型的液相色譜技術，由于該技術能夠快速對化合物進行分離與分析，理論塔板數可達幾千以上，因此較高效液相色譜而言，具有更為顯著的優點。由于高效逆流色譜技術不采用固相載體作固定相，因此能夠降低樣品吸附、樣品污染、樣品損失等情況的發生，并使峰形更佳，避免發生拖尾現象[2]。目前對于高效逆流色譜技術在中藥成分分析中的應用的研究與報道較少，因此本文就玄參中苯乙醇苷的分離與分析進行探討，旨在為高效逆流色譜技術的應用價值提供有力依據，具體報告如下。
1材料與方法
1.1試驗試劑本文選用的玄參為北京同仁堂藥店（成都分店）生產的炮制品，醋酸乙酯為色譜純（美國Honeywell公司）、正丁醇為色譜純（美國Honeywell公司），乙醇為色譜純（美國Honeywell公司），水為超純水（由超純水發生儀制造）。正己烷為分析純（成都長江化工試劑有限公司）。
1.2試驗儀器高效逆流色譜儀為英國Dynamic extraction公司生產，逆流色譜泵為德國KNAUER公司生產，型號為Smartline100。檢測器為紫外檢測器，德國KNAUER公司生產。本文中高效液相色譜實驗則采用安吉倫公司生產的Agilent2100高效液相色譜儀，檢測器為DAD，色譜柱為ODS-C18（色譜柱參數為150mm×5mm，5um），質譜分析儀使用Thermo Fisher公司生產的API 4000 Qtrap串聯四級桿質譜儀。
1.3樣品制備方法對本文選取的玄參藥材稱取其粉末500g，使用1500ml乙醇（80%）進行浸泡，并于室溫下提取，連續提取5次，每次提取時間為12小時。將提取液過濾后，將濾液合并，并將濾液進行減壓回收至體積為300ml。將減壓回收獲得的水液部分使用正己烷進行脫脂處理，共處理2次，每次使用300ml的正己烷。處理完畢后將正己烷棄去，剩余水層使用水飽和的正丁醇再萃取5次，每次使用300ml的正丁醇。將正丁醇層合并，并減壓回收至干燥。由此獲得的正丁醇提取物約6g，從中取近150mg供逆流色譜分析用。洗脫溶劑為醋酸乙酯-乙醇-正丁醇-水。將流出物使用HPLC-MS進行分析。
1.4高速逆流色譜溶劑的選擇在進行溶劑選擇的過程中，取1mg正丁醇提取物分別置入6個試管中，將固定相與流動相均加入2ml至相應試管中，渦旋60s后靜置1分鐘。分層后取上層溶劑100ul與下層溶劑100ul，蒸干后使用甲醇500ul進行溶解，過0.45um濾膜。本文選用的溶劑系統分別自6種溶劑系統中篩選得出，該6個溶劑系統分別為：醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（4：0.6：0.6：5）、醋酸乙酯-乙醇-水（5：0.5：4.5）、醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1：1：0.1：2）、正己烷-醋酸乙酯0正丁醇-乙醇-水（0.5：0.5：1：0.1：2）、醋酸乙酯-正丁醇-水（4：1：5）[3]。通過對比化合物在不同的溶劑中的K值可得，醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1：1：0.1：2）能夠大致滿足HPCC的分配系數要求（0.5-2.5），因此以此作為溶劑體系使用。
1.5高效液相色譜分析條件本文中HPLC采用二元泵梯度洗脫，流動相A為乙腈、B為0.5%醋酸水溶液。洗脫程序如下：0-1min，90%B；1-30min，70%B；30-35min，30%B；35-40min，90%B。流速設定為0.8ml/min，DAD檢測波長設定為320nm。柱溫箱設定溫度為25℃，進樣量為10ul。
1.6質譜分析條件本文MS質量范圍設定為50至2000，采用負離子模式，流速為5ul/min，ESI：4kV，CAD：N2，CUR：He，毛細管溫度：200℃。
2結果與討論
2.1高效逆流色譜分離結果溶劑體系達到平衡后，將上層液作為固定相使用，泵入螺旋管中，泵入速度為9ml/min。將逆流色譜的轉速調節為1500r/min。再將水液泵入螺旋管中，速度為3ml/min。當流動相流出且兩相平衡后，將事先制備好的玄參提取物注入至樣品管中，通過分離后將相同的組分峰合并。所得純化物通過HPLC-MS分析可得，與麥角甾苷標準品出峰位置相比，峰1與峰3均可能為麥角甾苷峰，而利用該兩種化合物在質譜中的碎片離子特征最終可以判斷，本文所得峰1為麥角甾苷峰，通過計算其純度為95.0%。而通過與安格洛苷C標準品出峰位置相比，本文所得峰6為安格洛苷C，通過計算其純度為92.0%。
2.2討論本文采用高速逆流色譜技術對中藥中常用的玄參中的苯乙醇苷類物質進行分析與分離，在極短時間內即得到了分離純度較高的麥角甾苷與安格洛苷C。由此可見，高速逆流色譜技術是針對中藥成分分析與分離的良好方法，具有準確性、靈敏度、分析速度均較高等優點。隨著科技的進展，高速逆流色譜技術的分離與分析技術將不斷得到改進與完善[4]，因此本文認為，高效逆流色譜對于中藥成分的分析具有更加廣闊的前景與更加重要的應用價值，值得進行推廣與應用。