2015年最熱門的質粒技術

　　無論是克隆和表達、還是基因組編輯，質粒都是我們必備的工具。常用的質粒，實驗室一般都有，或者隔壁實驗室有，那就你有我有大家有。不過，對于基因組編輯這種新的應用，手頭的質粒肯定不合適。2015年有哪些熱門的質粒技術出現？Addgene最近有統計。

　　分裂的Cas9系統

　　大家都知道，Cas9蛋白是由N端的DNA識別結構域和C端的核酸酶結構域組成的。張鋒的研究團隊利用Cas9的這種特殊結構，設計出一系列“分裂的”Cas9分子（split Cas9），它們不能單獨發揮作用，在二聚化后才能形成功能齊備的Cas9。

　　這種技術將野生型的Cas9分裂成N端（Cas9(N)-2xNLS）和C端（Cas9(C)-2xNLS）片段，以便實現共表達和自我組裝后的DNA靶點切割。為了對基因敲除或激活有更精確的時間控制，C端的cas9片段融合了FK 506結合蛋白12（Cas9(C)-FKBP-2xNLS），而N端融合了雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的結合結構域（Cas9(N)-FRB-NES），實現了雷帕霉素誘導的基因組編輯。

　　在沒有雷帕霉素處理時，Cas9(N)-FRB-NES片段被運出細胞核。在雷帕霉素處理后，Cas9(N)-FRB-NES和Cas9(C)-FKBP-2xNLS二聚化，流入細胞核，在那里形成有功能的Cas9分子。這個系統讓用戶能夠對CRISPR/Cas9介導的基因組修飾和基因表達有更好的時間控制。

　　Zetsche et al., Nat Biotechnol. 2015 Feb 2；33(2):139-42. doi: 10.1038/nbt.3149.

　　光誘導的CRISPR-Cas9系統

　　光遺傳學是一種強大的工具，它利用光來控制和監控單個活細胞，以了解它們如何工作。光活化讓科學家能夠從時間和空間上控制哪些基因開啟或關閉。此前，科學家已經利用DNA引導的光遺傳學工具成功調控基因轉錄；不過，讓光活化的蛋白結構域到達特定位置還是蠻困難的。

　　為了克服DNA引導系統（如TALEN或ZFN）的許多限制，Gersbach實驗室修改了RNA引導的CRISPR-Cas9系統，開發出一種快速而靈活的工具。在這個系統中，Polstein和Gersbach融合了光誘導的蛋白結構域CibN和Cry2，分別讓dCas9和VP64失活。CibN和Cry2形成異源二聚體，可用藍光活化。它們將VP64反式激活因子和dCas9定位到基因組的特定位點上，并激活轉錄。這種LACE技術有著許多潛在的應用。

　　Polstein LR & Gersbach CA, Nat Chem Biol 2015 Mar；11(3):198-200.

　　明亮的SunTag系統

　　在蛋白成像的過程中，一般的思路是將蛋白質與熒光蛋白（如GFP）融合。然而，在普通的熒光顯微鏡下，帶GFP結構域的單個蛋白是很暗淡的，但添加太多GFP結構域又會讓蛋白變得過大。于是，加州大學的研究人員開發出SunTag系統。

　　這個系統是一個合成的支架，最多能招募蛋白質的24個拷貝。具體而言，在目的蛋白上融合多個同源的肽段表位，之后用融合sfGFP的scFv抗體對其進行熒光標記。這個系統放大了熒光信號的強度，實現了活細胞內單分子的追蹤，而不會影響蛋白質的功能。與dCas9融合后，SunTag系統也能上調基因表達。研究人員曾試過將多個拷貝的VP64招募到sgRNA靶定的基因，提高了靶基因的轉錄水平。

　　Tanenbaum et al., Cell. 2014 Oct 8. pii: S0092-8674(14)01227-6.

　　高效的克隆載體

　　新西蘭惠靈頓維多利亞大學的研究人員開發出一種自適應的細菌表達載體，使克隆效率和基因表達接近100%。這種pUCXKT載體確保所有篩選的質粒都含有一個基因變異，且適用于高通量和低通量的篩選應用。這個系統能夠輕松修改，以使用不同的抗生素、限制性內切酶和質粒骨架。

　　pUCXKT載體含有一個截短版本的卡那霉素抗性基因，缺少了最前面的兩個密碼子。在截短基因和啟動子之間插入了兩個終止密碼子，以防止這種抗性的滲漏表達。與之前的系統不同，pUCXKT載體不會引起抗生素表達框與目的基因的融合翻譯。

　　在擴增待表達的基因時，正向引物是基因特異的，含有所需的限制性酶切位點（MCS），而反向引物含有抗性基因缺少的密碼子、核糖體結合位點、SacI限制性酶切位點以及一個接頭區。之后將PCR產物連接到pUCXKT的MCS/SacI位點上，去除終止密碼子，補上抗性基因缺少的密碼子。因此，pUCXKT重組克隆就具有卡那霉素和氨芐青霉素的抗性。