多羥基反應單克隆抗體的鑒定、生產和使用——免疫親和層析

實驗步驟

一、多羥基反應單克隆抗體

我們最先使用了一類特殊的單克隆抗體, 并將其用于免疫親和層析。這些抗體可以用于溫和的免疫親和層析, 因為洗脫條件只需要聯合使用無離液鹽和低分子質量的多羥基化合物 (多元醇），此條件下蛋白質呈非變性狀態。我們把這種抗體歸類為多羥基反應單克隆抗體 (PR-mAb)。

我們的實驗室研究蛋白質轉錄。因此，我們分離出的大部分 PRmAb，是原核或真核系統中與轉錄相關的 mAb。對于主攻分離的科學家，真核生物轉錄系統具有重大的挑戰性, 因為實際上許多因子都是多亞基蛋白質。例如，真核生物的 RNA 聚合酶 n(RNAPn) 含 12 個亞基 (12 個不同基因產物）。然而，從啟動子起始轉錄，rnapn 還需要轉錄因子 TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF 和 TFIIH[綜述見 Woychik 和 Hampsey(2002)]。除 TFIffi 外, 所有這些轉錄因子均是由兩個或兩個以上的亞基組成。大蛋白質復合物是使用 PR-mAb 免疫親和層析的理想對象。我們已經研發用于大腸桿菌 RNAPCThompsonetal.,1992) 和真核生物 RNAPII(Thompsonetal.，1990) 的 PR-mAb，以及針對一些真核生物轉移因子 (表 28.1) 的 PR-mAb。

PR-mAb 技術應用中最值得注意的是，采用我們的 PR-mAb8WG16 純化的酵母 RNAPIKEdwardsetal.,1990) 已用于蛋白質復合物結晶（Crameretal.，2000)。其他實驗室已成功分離出多種 PR-mAb, 并應用于純化目標蛋白質 (Jiangetal.，1995;Lynchetal.，1996;Nagyetal.,2002)。也可以對已經確定的 mAb 進行篩選，將其用于多羥基反應。

目前已經發表了一些關于 PR-mAb 的綜述（BurgessandThompson,2002;Thomp-sonandBurgess，1996,2 0 01;Thompsonetal.，2 00 6)。本章中，我們將對其中一些方法進行更新。我們還將介紹采用非常便宜的細胞培養系統制備大量 RP-mAb 的方法，以及以同樣的方式用小鼠腹水制備極少量的 mAb。最后，根據抗體的多羥基反應特點，以重組 DNA 的方法, 用 RP-mAb 的表位標記無關目標蛋白質，可進而通過溫和的多羥基-洗脫法純化該蛋白質。

1.PR-mAb 特性

(1) 通過篩選大量單抗（218 個抗原特異孔），我們預計 PR-mAb 占單克隆抗體的 5%~10%(Thompsonetal.，1992)。

⑵在主孔 (master-well) 階段進行篩選可以立即鑒定 PR-mAb。

(3)PR-mAb 不受小鼠 IgG 亞型的限制。也已在大鼠的 mAb 中鑒別篩選了 PR-mAb(R.R.Burgess, 數據未公開發表）。

(4) 多數 PR-mAb 受不同種鹽和多羥基化合物組合的影響。最常見的是 0.75mol/L 硫酸銨或 0.75mol/L 氯化鈉與 30%~40% 丙二醇聯合使用。

(5)PR-mAb 可以是高親和力抗體。事實上, 在稀釋溶液中，高親和力是保證 mAb 與抗原有效結合的首要條件。洗脫時成為低親和力抗體。

(6) 多數 (不是全部)PR-mAb 受不同種鹽和多羥基化合物組合的影響。經驗證，鹽包括硫酸銨、氯化鈉、乙酸鈉和谷氨酸鉀! 多元醇包括丙二醇、乙二醇、2，3-丁二醇，有時甘油也可。

(7) 鹽和多經基化合物通常用來作為蛋白質穩定劑, 其溫和洗脫作用可以保留抗原的生物學特性及結構的完整性，甚至可用于多亞基復合物（CrameretaL，2000;Thomp.sonetal.，1990)。

2.mAb 來源

我們采用雜交瘤技術制備 mAb(Harl o wandLane,1988)，即將抗原刺激的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞株融合。實驗證明應首選高免小鼠; 僅 5%~10% 的單抗是 PR-mAb，因此需要大量的原始雜交瘤細胞才可能分離出 PR-mAb。但可以使用其他方法制備 mAb, 如反轉錄病毒感染漿細胞 (Largaespadaetal.，1”6)，或通過重組技術構建抗體庫。

無論何種來源的抗體，必須具備抗原特異性。我們發現，標準 (ELISA) 是行之有效的方法。接著我們通過改良的 ELISA 法篩選抗體，即 ELISA-elution 檢測法。該方法是在標準 ELISA 的基礎上，在加入酶聯二抗前，增加了用鹽和多羥基化合物聯合處理特異性的抗原抗體復合物的步驟。接著，用鹽/多羥基化合物解離抗原抗體復合物后, 通過底物反應進行定量。ELISA-elution 檢測法的一般程序如下所述。

3.PR-mAb 的 ELISA-elution 檢測法

(1) 抗原包被聚苯乙烯微孔板。通常每孔加入 50 含有 30~100ng 抗原的磷酸鹽緩沖液 (PBS，PH7.4)。室溫孵育 Ih，保證足夠的時間使抗原與聚苯乙烯結合。

(2) 每孔用 200 斗含 1% 脫脂奶粉的 PBSd%BLOTTO) 封閉。通常在 4°C 封閉過夜, 室溫下 2 h 即可。

(3) 將待測抗體 (50(uL) 加入相鄰的兩個孔，室溫孵育 Ih。通常細胞培養液中的抗體可以直接使用 D 但是，親和力非常髙的抗體，或滴度非常高的抗體制劑應稀釋至非飽和水平使用。

(4) 用含 0.l%tween20 的 PBS(PBST) 洗板 5 次，去除未結合的抗體。

(5) 對照孔，每孔加入 100fJLTE 緩沖液 [50 mmol/LTris-HCl(pH7.9)，0.1 mmol/LEDTA]; 待測孔，每孔加入 100 含 0.75mol/L 硫酸銨和 40% 丙二醇的 TE 緩沖液。

EUSA 板室溫孵育 20 min，偶爾 (約每 5 min) 輕拍 ELISA 板一側以混合溶液。

(6) 用 PBST 洗板 5 次。

(7)1%BLOTTO 稀釋商品化辣根過氧化物酶標記的二抗 (一般 1:2000)，每孔加人 50|uL。室溫孵育 Ih。

(8) 用 PBST 洗板 10 次。

(9) 向孔中加人適當底物。我們使用的是 100^含有 0.03%H2O2 和 0.4 mg/mL 鄰苯二胺 (OPD) 的 0.05mol/L 檸檬酸緩沖液 (pH5.0)。

(10) 酶聯板在室溫下孵育 5~15 min。成對 (TE 和 TE+鹽/多元醇對于每種單抗）終止反應，每孔加人 50fxLImol/LH2SO4。

(11) 酶聯儀讀取吸光值。對于（)PD, 檢測波長為 490nm。與僅加入 TE 緩沖液的對照孔相比 (圖 28.1A)，經多羥基化合物和鹽處理的待測孔中,PR-mAb 的吸光值將降低約 50%。如果無酶聯儀可用, 吸光值通常降低約 50% 時目測也是很明顯的。

說明

(1)PR-mAb 篩選可以在主孔階段 (master-wellstage) 進行操作。雜交瘤細胞篩選用于特異性抗體制備，隨后立即進行 PR-tnAb 篩選。初步篩選可以在 100 細胞培養液中進行 (50 對照緩沖液和 50；^含多羥基化合物及鹽的緩沖液)（Thompsonetal.，1992)。其中一項研究中, 在主孔階段，僅一次融合我們就篩選了 200 個以上雜交瘤細胞用于制備 PR-mAb。

(2) 抗原結合于微孔板上可導致抗原結構的變化。這樣可能會導致在溶液中埋藏于蛋白質內部的表位暴露, 進而導致假陽性，因為在溶液中 mAb 與目標不反應，這種 mAb 不適用于免疫親和層析。

(3) 當有數毫升細胞培養液可用時, 可以在一塊板上檢測不同濃度的多元醇和鹽對 mAb 的影響（圖 28.1B)。

4.連續培養法生產 mAb

在許多情況下，已經不再鼓勵用腹水生產小鼠 mAb 的做法。因此，我們已經研發了替代的方法用于生產免疫親和層析所需的大量 mAb。這部分將介紹一種已經證實非常適合用于這種規模的抗體制備方法。該操作程序中, 使用一種商品化的由 IntegraBiosciencesAG 公司（瑞士）生產的 CELLineFlask350(CL350) 細胞培養室。美國 ArgosTechnologies 公司（Elgin,IL) 和 BioracoInternational 公司（Framingham,MA) 也提供這種產品。我們發現這個產品易于使用，能夠制備 10~50 mg 抗體，且相同的雜交瘤細胞可重復使用數次。需要具備的條件包括: 標準的無菌細胞培養技術、細胞培養罩 (cellculturehood) 和 WC 恒濕二氧化碳培養箱 (5%)。這種培養瓶的示意圖如 28.2A 所示。常規操作規程如下所述。

(1) 準備細胞培養基。準備兩種略有差異的培養基用于兩個 CL350 培養皿。杜爾伯科改良伊格爾培養基 [Dulbecco’smodifiedeaglemedium(DMEM)] 含有谷氨酰胺和高濃度的葡萄糖 (Gibco/Invitrogen#11965)，再加入 Immol/L 丙酮酸納 (Sigma 公司）、100 單位/mL 青霉素、100fxg/mL 鏈霉素 (Gibco/Invitrogen)，作為兩種培養基的基礎成分。在細胞生長室中，DEME 需添加上述成分和 15% 滅活的胎牛血清（Hycl0ne 公司）。

在營養維持室中，DMEM 需添加上述成分和 5% 胎牛血清的 DMEM 培養液。我們將細胞生長室用培養基稱為「完全培養基」（completemedium)，將營養維持室用培養基稱為「營養培養基』』(nutrientmedium)。

(2) 準備用于接種培養瓶的接種液。從液氮罐中取出一管雜交瘤細胞,37°C 迅速解凍。將雜交瘤細胞按照約 2XIO4 個細胞/mL 密度用完全培養基鋪板。我們使用含有 20 mL 培養基的 10 cm 細胞培養板。

(3）接種培養瓶。準備 5 mL 新鮮的完全培養基，含有 8XIO6~20XIO6 個處于對數生長期的活細胞。在細胞鋪于細胞生長室前, 將 25 mL 營養培養基加至營養維持室 (綠蓋）中，浸潤營養維持室和細胞生長室之間的膜。懸浮細胞, 并用 10 mL 的血清移液管吸出。擰松綠蓋，將吸管穩穩插入細胞生長室，向細胞生長室（白蓋) 中接種 5 mL 懸浮液。

緩慢的上下吹打液體，在將液體吹回室內前使氣泡上升，進而除去氣泡。更換白蓋并擰緊。向營養維持室中加人 35 0 mL 營養培養基，擰緊綠蓋。

(4) 收獲細胞生長室和培養維持。每隔 3~7 天更換營養維持室中的營養培養基。

擰松綠蓋，將 10 mL 移液管插入細胞生長室, 上下吹打液體，徹底混合細胞。然后將整個細胞生長室中的液體全部轉移至離心管。由于滲透通量，體積可能大于 5 mL。取樣后用血細胞計數法進行細胞計數，臺盼藍進行活細胞染色檢測。取出細胞生長室中的內容物離心沉淀細胞。取出合并含有 rnAb 的培養基, 將該上清液凍存以備日后純化。用新鮮的完全培養基重懸細胞。可能需要根據初始接種密度、增長率和換液頻率，將細胞分成幾份 (通常為 1:2~1:4)。擰松綠蓋，將 5 mL 的細胞倒回至培養皿中（白蓋）。去除氣泡和擰緊白蓋。向營養室中加入 350 mL 培養基，徹底擰緊綠蓋。

(5) 培養方式建立后，每隔 3~7 天收獲 IntegraCL350 瓶一次。收獲時間間隔取決于雜交瘤細胞增長速率和雜交瘤細胞對培養瓶環境的適應能力。這一特點具有細胞系依賴性。

說明

(1) 用 IntegraCL350 瓶培養雜交瘤細胞的效果很好, 每毫升細胞培養收獲上清液中，可以得到 mAb0.5~Img。通常可連續培養 1 個月左右。

(2) 處理液體：將培養基在 37°C 水浴預熱。這有助于避免培養瓶中的冷凝作用以及細胞的溫度休克向細胞培養皿 (白蓋) 添加或取出液體時, 要先擰松營養培養室的綠蓋，以防止留有空氣。放人培養箱孵育之前始終擰緊培養瓶的白蓋和綠蓋。建議使用 IOmL 血清移液管進行操作。將培養基吸出并加人新鮮的培養基, 為營養維持室換液。

(3) 接種的最低細胞濃度為 1.5X106 個細胞/mL[步驟 (2)]。我們嘗試降低營養培養基中所需的胎牛血清，但未獲成功。一些市場上的新型無血清培養基可以用做營養培養基。

(4) 監測細胞數量和狀態很重要 [步驟 (3)]。有助于確定是否分離細胞，以減少細胞數量，避免總活細胞數大于 I.OXlO8 個。如果細胞活力大大降低，則需要增加換液頻率。

(5) 在連續培養過程中，由于每次收獲均分離細胞，引起細胞死亡而導致活細胞比例 [步驟 (4)] 下降。培養期末, 僅有 30%~40% 活細胞是非正常終止的。

(6)—些雜交瘤細胞在長期連續培養時是不穩定的, 并失去產生抗體的能力。因此，在培養期間應監測抗體生成。我們采用標準 ELISA 檢測。

(7)CELLine 培養瓶的信息可以在 www.integrabiosciences,COM/celline 獲得。

5.抗體純化

為將抗體與載體上可用反應位點間的結合最大化, 需要純化抗體，至少部分純化也是有益的。可以用多種不同的方法純化抗體。其中最經濟實用的方法是分子排阻色譜或離子交換層析。常用的純化方法是利用 ProteinA、ProteinG，或兩者混合進行親和層析, 但這種方法耗費較髙。小鼠 111 八 1) 屬于免疫球蛋白化 04 個亞類之一：^0 1、：^02&、龜 02 匕和 IgG3。小鼠 IgG2a、IgG2b 和 IgG3 可以用 ProteinA 層析柱純化。小鼠 IgGl 與 ProteinA 結合的效果差。與小鼠 IgG2a 不同，小鼠 IgGl 與 ProteinG 結合效果更好，而 IgG2b 與 ProteinA 和 ProteinG 均可結合。

根據我們的經驗，大部分典型融合實例中的單抗都是 IgGl 亞類。這里我們介紹一種 DEAE 柱 (WhatmanDE52)，可以用于純化小鼠 IgGmAb，該層析柱既經濟，又簡單。

對于 mAbIgGl, 這種方法特別有效。事實上，在我們的操作中，每個純化后的 igG1mAb，經檢測純度均可達 90% 左右。此外，許多小鼠的 IgG2a 和 IgG2b 抗體可以通過這種方法純化。

(1) 無論是腹水或 CELLine 細胞培養上清液中的抗體均需采用硫酸銨沉淀。向 mAb 中加飽和硫酸銨溶液至奶％ 飽和度。冰上攪拌漿體 2 0 min。通過這種方式沉淀 mAb，同時大部分血清白蛋白留在溶液中。

(2) 離心分離沉淀 (約 6000 盡,10 min)。向沉淀中加入抗體用緩沖液 [50 mmol/LTris-HCKpH6.9),25 mmol/LNaCl], 加入量為抗體初始體積的 l/4(CELLine 培養瓶制備抗體).1/2(腹水)。

(3)15 min 左右可溶解沉淀，離心使其澄清 (約 6000IOmin)。

(4)4°C 條件下，將步驟 (3) 得到的上清液用 IL 抗體用緩沖液透析過夜。

(5) 澄清的上清液用于 DE52 柱層析，按照下面「說明」中事項準備層析柱。層析柱用抗體用緩沖液 (pH6.9) 平衡, 該 pH 條件下，大部分 mAb 流穿，而多數雜質會與層析柱結合。10 mL 原料可用 5 mLDE52 柱。

(6) 收集原料中未與層析柱結合的組分 (約 ImL)，每個組分樣品進行 SD&PAGE 檢測。CL350 培養瓶制備 mAb8RB13(IgGl 型單抗），純化產物的 SDS^PAGE 結果如圖 28.2B 所示。根據抗體純度合并分離組分。

(7) 用 5 mL 含 0.5mol/LNaCl 的抗體用緩沖液洗脫層析柱,PAGE 分析前保存洗脫液。

說明

(1)DE52 的準備工作十分重要。雖然生產商宣稱不需要預循環, 但是我們證實預循環大大改善了色譜性能。10 g 樹脂混懸于 100 mL 水中, 并用 100 mL 水清洗數次, 每次清洗可去除細小物 (不沉降的小顆粒)。然后用 100 mL0.Imol/LHCl 處理樹脂 30 min, 將 HCl 緩慢倒出。至少清洗 3 次樹脂, 每次用 100 mL 水。最后一次清洗緩慢倒出液體，然后用 0.Imol/LNaOH 處理樹脂 30 min, 緩慢倒出液體，至少清洗 3 次樹脂，每次用 100 mL 水。用抗體用緩沖液清洗樹脂 3 次，每次用 100 mL 緩沖液, 并用相同的緩沖液懸浮。用 pH 試紙檢測 pH，加人疊氮鈉至終濃度 0~ 0 2%。樹脂分裝于一次性試管，存放于冰箱內。

(2)mAb 可來源于腹水。雖然腹水并不純 (純度 80%~90%), 但雜質可能并不影響免疫親和樹脂的性能。

(3) 在上述條件下，大多數小鼠 mAb 可流穿 DE52。但仍有少量 mAb 可以結合于層析柱。因此，可以采用高鹽洗脫條件 [步驟 (7)] 洗脫抗體。使用鹽梯度濃度純化與 DE52 層析柱結合的 mAb 是必要的。

(4) 如果以 CELLine 培養瓶制備 mAb，可不必采用 DE52。

6.PR-mAb 在層析載體上的固定

供應商提供了很多種樹脂和偶聯劑。我們已經對其中的大部分進行了驗證，但沒有任何一種比用溴化氰 (CNBr) 衍化的交聯瓊脂糖更有效。

（1）純化后 mAb 用偶聯緩沖液透析 (1 00 mm o l/LNaHCO3、500 mmol/LNaCUpH8.3)。移出透析管中的抗體溶液，并用偶聯緩沖液調整其體積，每克溴化氰活化的 Seph-arose 干粉對應 10 mL, 留樣 (約 1 00^L) 分析蛋白質濃度。

（2）約需 20 min 溴化氰活化的 Sepharose 干粉即可溶脹于 0.Immol/LHC1。每克溴化氰活化樹脂干粉可制備 3.5 mL 凝膠。然后在玻璃濾器內清冼樹脂，每克樹脂用約 100 mL0.Immol/LHCl。

(3) 用約 20 mL 偶聯溶液快速清洗樹脂后，將樹脂轉移至抗體溶液中。23°C 條件下，用實驗室旋轉器將膠漿液翻轉混合 2 h。

(4) 用玻璃過濾器收集樹脂, 保存濾液用于測定未偶聯蛋白質含量。

(5) 將樹脂轉移至約 1 0 1111^1”[8.3、1111 0 1/1 乙醇胺溶液中,23。(：翻轉混合 211, 使乙醇胺與殘余的溴化氰充分反應。

(6) 再次用玻璃過濾器收集樹脂，偶聯緩沖液 (約 50 mL) 清洗后，用 100 mmol/L 乙酸鈉緩沖液 (pH4.0) 清洗。

(7) 重復至少 2 次或 3 次步驟 (6) 中的 2 次清洗。

(8)4°C 條件下，將偶聯的 Sepharose 保存于 I0 mL 含 0.02%NaN3 偶聯緩沖液中。

(9) 檢測結合前后保存的抗體溶液 [步驟 (1) 和 (4) 得到的樣本] 中的蛋白質含量。據此確定偶聯效率。

說明

(1)Ig 樹脂干粉制備 3.5 mL 溶脹樹脂。我們發現多數情況下，—次處理 0.5~2.0 g 樹脂干粉比較方便。并且證實 ImL 溶脹樹脂偶聯 2.5 mgmAb 效果較好。因此，3.5 mL(lg) 樹脂需要結合 8.75 mgmAb。

(2) 溴化氰活化的 pH 條件是 8 以上。因此, 上述步驟 (3) 中的抗體溶液應盡快轉移至樹脂。

(3) 阻斷劑 [步驟 (5)] 可依據具體使用目的而異。例如, 產自酵母的乙醇胺結合蛋白，如果用乙醇胺作為阻斷劑，將會與目標蛋白質共純化。在這種情況下，almol/L 甘氨酸是比較合適的阻斷劑。

(4)4°C 條件下，將樹脂儲存于 0. 0 2%NaN3 中。該條件下，樹脂可以穩定儲存約 6 個月。我們注意到，一些抗體儲存 6 個月后會發生剝離。向上述緩沖液中加入 50% 甘油，存儲于 20°C(不凍結），可能延長半衰期。

7.用 PR-mAbs 純化蛋白質

下面我們以 mAbNT73 或 8RB13 純化大腸桿菌來源的 RNA 聚合酶為例。前面介紹一步免疫親和層析法可以得到純度約 90% 的 RNA 聚合酶。其他一些與 RNA 聚合酶結合的蛋白質也會被共同洗脫。該操作規程設定原料為 IL 對數生長末期培養液獲得大腸桿菌沉淀（2~3 g 濕重）。圖 28.3 所示 SD^PAGE 結果為利用該方法純化的結果。

(1) 可以在冰上部分復融沉淀，并用 20 mLTEN 緩沖液 [50 mmol/LTris-HCl(pH7.9)、0.Immol/LEDTA、100 mmol/LNaCl] 重懸。

(2) 添加溶菌酶至終濃度 250pg/mL, 冰上孵育細胞 20 min。或者使用 1500kU 重組溶菌酶 (EMD/Novagen 公司#H110)。

(3) 冰上超聲細胞, 重復 4 次，每次工作 15s，間歇 15s。

(4)15000r/min(27000 g) 離心裂解液 15 min。

(5) 于 23°C 將上清液 (1~2 mL) 上樣于免疫親和柱，收集流穿部分。

(6) 用含 100 mmol/LNaCl 的 TE(約 20 mL) 清洗層析柱，然后再用含 500 mmol/L(原文為 500 mL, 譯者認為原文筆誤）NaCl 的 TE(約 5 mL) 清洗層析柱。用含 100 mmol/LNaCI 的 TE(約 10 mL) 再平衡。

(7) 用含 0.75mol/LNaCl 和 40% 丙二醇的 TE 洗脫層析柱 (室溫）。冰上收集洗脫組分。

(8)SDS-PAGE 電泳分洗脫峰。圖 28.3 中 SDS-PAGE 結果顯示一步層析產物純度。合并所需組分（圖 28.3 泳道 5、泳道 6)，用合適的儲存緩沖液透析 [轉錄蛋白，用 50 mmol/LTris-HCl(pH7.9),50 mmol/LNaCUO.Immol/LEDTA.O.lmmol/LDTT 和 20%~50% 甘油]。

說明

(1) 用 Benzonase 核酸酶處理裂解液 [步驟（3)](EMD/Novagen#7 0 746，Madison,WD，有助于消化核酸和降低黏度 (見本書第 18 章）。

(2)500 mmol/LNaCl 清洗 [步驟 (6)] 有助于消除核酸和 NusA, 后者為一種 RNA 聚合酶結合蛋白。

(3) 室溫下洗脫目標蛋白質比 4°C 條件下更有效 [步驟 (8)]，原因未知。

8.用 PR-mAb 的交叉反應純化蛋白質

通常可從非基因工程制備的生物材料中純化蛋白質或蛋白質復合物。并且發現，使用識別高度保守表位的 PR-mAb 可以使免疫吸附的適用性更強。其中兩個應用最成功的 PR-mAb 可以與許多物種的同一種酶發生交叉反應。

mAb8WG16 與真核生物 RNAPn(表 28.1) 最大亞基 C 端的重復七肽產生相互作用。這一序列是該大蛋白質復合物表面容易靠近的部分，通常稱之為 RNAPII 的 C 端結構域 (CTD)。RNAPII 中的 CTD 對于所有物種幾乎都是高度保守的。mAb8WG16 已用于純化小牛胸腺（Thompsonetal.,1990)、酵母（EdwardsetaL,1990) 和人體細胞 (Maldonadoetal.,1996) 中的 RNAPII。

事實上，PR-mAb 純化的酵母 RNAPII 第一次應用是在 RNAPII 晶體化研究方面 (Crameretal.，2000)。我們已經介紹了利用 PR-mAb 純化 RNAPU(ThompsonandBurgess,1996) 的詳細過程。在大多數情況下，從原料中純化 RNAPII 時需要在使用免疫親和樹脂之前先采用直接混合的純化程序。

mAb8RBI3 是一個具有高度交叉反應的 PR-mAb, 已證實對純化細菌核 RNA 聚合酶（coreRNAP) 非常有效（Bergendahletal.，2003;Probascoetal.，2007)。這種 PR-mAb 可與大多數細菌來源的 RNA 聚合酶高度保守的「卩-flap」結構域發生反應 (E.S.Stalder, 未公開發表)。是一個與 sigma 亞基結合的主要位點（Kuznedelovetal.,2002)，因此可用 8RB13-agarose 層析柱純化 RNA 聚合酶 (缺少一個 sigma 亞基）。圖 28.4 泳道 3 為由大腸桿菌純化的核 RNA 聚合酶。鑒于該 mAb 的交叉反應，也可以從枯草芽孢桿菌中純化核 RNA 聚合酶 (泳道 4)。圖 28.4 也顯示了用 mAbNT73 從大腸桿菌中純化的 RNA 聚合酶 (泳道 2)，這是一種全酶 (holoenzyme) 與核心酶 (coreenzyme) 的混合物, 兩種形式酶組分可以用離子交換色譜法分離 (Thompsonetal.,1992)。純化大腸桿菌和枯草芽孢桿菌來源核 RNA 聚合酶時，與主要的 sigma 因子對應的肽段是缺失的。

9.使用 PR-mAb 的抗原表位作為純化標簽

我們認為，標準雜交瘤技術分離得到的 5%~10%mAb 都可能是有效的 PR-mAb，即使如此，也可使用另一種方法, 即用已確定為 PR-mAb 的 mAb 的表位對蛋白質進行表位標記。純化標簽的方法在第 I6 章中已介紹。因此，我們將只簡單地介紹這一內容，并且僅涉及與 PR-mAb 和其抗原表位相關的部分。

可以用表位標記蛋白質，并用 PR-mAb 通過多輕基反應純化蛋白質，這種能力正是抗體自身特性使然，而不是表位存在的情況下反應條件的特征決定的。我們已經為 3 個 PR-mAb 開發了表位標記系統，分別為 NT73、IIB8、8RB13(DuellmanetaL，2004;Thompsonetal.,2003;E.S.Stalder，未發表資料）。我們稱這些表位為「軟性標簽 (3 此-ags)」(BurgessandThompson，2 00 2)。表 28.1 中已列出這些表位，且這些標簽已獲ZL授權（Burgessetal.,2007)。

我們所有 PR-mAb 的分離均以全長蛋白質作為免疫原，因此，這類 mAb 表位的定位是一個辛苦的過程。用合成肽作為免疫原分離 PR-mAb 雖然可行但我們并未采用。PR-mAbIIB8PR-—可以與人 TFIffi 反應—是通過定點突變、用噬菌體展示技術定位的 (Duellmanetal.，20 0 4)。而與大腸桿菌 RNA 聚合酶最大亞基反應的兩個 PR-mAb(rnAbNT73 和 mAb8RBI3)，是先通過有序片段梯度法（orderedfragmentladdermeth-o d) 進行非嚴格定位 (BurgessetaL，2000;Ra o etal.,1996), 然后通過細微缺失分析及寡核苷酸標記無關蛋白質 (Thompsonetal.，2003;E.S.Stalder, 未發表數據) 的方式精確定位，這種無關蛋白質我們已有相應抗體。這種寡核苷酸標簽的構建是將一段寡核苷酸與目標蛋白質基因融合，這個寡核苷酸包含與目標蛋白質讀碼框相容的、編碼表位的序列。

在該技術的原理論證 (proof-of-principle) 研究中，我們以綠色突光蛋白 (GFP) 為目標蛋白質（DuellmanetaL,2004;Thompsonetal.,2003)。mAbNT73 的表位標簽可以與 GFP 的 N 端或 C 端融合，但對于其他目標蛋白質，可能取決于其末端的可及度。對于 o..，其晶體結構中兩個末端均易靠近 (丁也 11，1998)。111 八匕 81^13 的表位已經用做大腸桿菌和哺乳動物細胞培養系統的標簽 (E.S.Stalden 未發表）。

我們已經將大腸桿菌 RNAP 來源的表位標簽用于純化大腸桿菌表達系統產生的表位標記 GFP, 即便如此仍有內源性 RNAP 存在于裂解液中，同時也有一些 RNAP 被純化。圖 28.4 的泳道 5 顯示了大腸桿菌表達、NT73-Sepharose 純化的表位標記 GFP，其中的表位是針對 mAbNT73 表位。將裂解液加至 300 mmol/L 的 NaCU 同時加入 0.3% 聚乙烯亞胺 (PEI)，可以去除其中的 RNA 聚合酶 (見本書第 20 章）。可以通過離心去除沉淀，而表位標記 GFP 仍在溶液中，然后將上清液用于免疫親和層析。

結論

本部分介紹了 PR-mAb 的分離和鑒定，以及其在溫和的免疫親和層析方面的應用。

雖然這里列舉的 PR-mAb 應用實例是將其用于純化轉錄因子, 但是本章概述的方法可以用于任意一種 PR-mAb 或用某種 PRrmAb 表位標記的蛋白質。該程序中耗費最大的部分是 PR-mAb 分離。現在針對某一種蛋白質的 mAb 非常多，可以利用 ELISA-elution 檢測法對現有 mAb 進行篩選，繼而用于多羥基反應，因此完全可能已存在一種針對你的目標蛋白質的 PR-mAb。

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