一 引物的設計
引物的設計對于這個實驗至關重要，因為real time pcr的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：
1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。
2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。real time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。
3，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。
4，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。
5，注意引物設計好后的產物長度。REAL TIME PCR的最佳產物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實驗誤差，但是我對這個說法持懷疑態度。產物長度越大，SYBR嵌入的越多，這樣才能夠保證最后的熒光值比較可信）。
6，不同的管家基因擴增效率不同。所以在做整個實驗之前應該做一次檢測擴增效率的實驗。如果擴增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法來比較基因表達量的高低。
二 模板的要求
歸根到底，REAL TIME pcr想要檢測的是目的基因表達量的高低，所以對整個實驗過程中模板的質量要求必然很高，我以自己的一些經驗說一下操作過程中的一些關鍵點：
1，用TRIZOL提取RNA有范圍要求。細胞數必須在一個范圍之內才能提取出高質量的RNA，所以我們在提取前必須知道細胞數（一般6孔板中兩個孔就可以提取出RNA）。
2，加入氯仿抽提過程中盡可能不要吸到中間層（中間層為基因組DNA，對上機做REAL TIME PCR很不利，會導致起始熒光值很高，無法跑出完整的擴增曲線）。
3，提取完后用乙醇溶解要盡可能使得乙醇揮發掉，但是不要過分揮發。（乙醇沒有揮發干凈會對后續的擴增效率有影響。在乙醇存在的情況下，DNA更加難溶，這就是醇沉的道理。但是過分揮發，RNA又不溶于水，會造成后續反轉錄量不高）。
4，反轉錄過程的操作盡可能在冰上。我們用的是OLIGO DT18，為了盡可能的消除RNA之間的二聚體，我們將RNA和OLIGO
DT18在一起70度變性10分鐘后，馬上冰浴2分鐘，再加入后續的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE
INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一個小時完成延伸過程（也有的步驟上將RNA先70度變性10分鐘，再加入OLIGO
DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在變性完再加OLIGO
DT18時，加的比較晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚體，導致前面的變性沒有意義）。
5，反轉錄完后將cDNA -20度保存，盡可能不要反復凍融（可以以10UL為一個單位來分裝cDNA）。
6，在加樣的過程中需要特別注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，這樣可以消除不同管之間引物濃度的差異。（2）最后加模板的時候需要一把很準確的移液器，以便確保每次加進去的樣一致，注意不要沾管壁（大部分人說需要混勻，但是我認為只要確保加入到體系中就可以，不用刻意混勻。因為我們在反應前有個95度變性，大家可以想象一下，在95度時候體系內的分子運動是很劇烈的，完全可以混勻），有條件的話可以加ROX,來消除不同的加樣體系來造成的誤差。（3）加樣完畢后最好離心一下，防止沾壁。
三 上機操作
在做整個實驗之前，應該對實驗有個整體的計劃，每個管中所加的物質要有計劃。在程序上編好號碼，選好需要進行的熔解曲線（因為機器剛開始是默認為不進行熔解曲線，切記）。可以選擇兩步法（產物長度較小，退火和延伸都在60度完成），也可以選擇三步法（產物較大，只能分為3步，且應該根據產物的長度來確定延伸時間，因為TAQ酶的延伸速度最少也在50BP/S，因此可以換算出所需要的延伸時間）。擴增完畢后進行熔解曲線，這個是必須要有的，因為這樣才能鑒定你產物的特異性和有無引物二聚體。如果前幾次做的話最好在做完REAL
TIME PCR后將產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，來確定自己的判斷。
四 分析數據
用的比較多的是用雙DELT法相對定量，而絕對定量則必須要進行標準曲線的制備，需要對這個基因構建質粒，克隆分離。所以我們對基因表達量高低用雙
DELT法（前提是擴增效率要一致）。熔解曲線觀察，如果同一基因的熔解曲線不一樣，則造成結果不一致，重復性很差，因此要多摸條件，盡可能使熔解曲線一致。
實驗步驟：
1. 設計引物，溶解成為10mM的濃度。
2. 提取RNA，反轉錄成CNDA。
3. 常規PCR以實驗所得模板擴增看家基因40個循環，電泳看產物多少。如果少，則不能進行REAL TIME PCR操作。
4.編寫好程序，加樣，上機。