| 實驗步驟 | 一 材料與設備
溶液均用 DEPC 水配制：
1)5.7moI/LCsCl 溶液。
2)10 mmol/LEDTA,pH7.5
3)DEPC 水
4) 變性緩沖液：50% 甲酰胺，12% 甲醛，IXMOPS 緩沖液（40 mmol/LMOPS,10 mmol/L 乙酸鈉，lmmol/LEDTA,pH7.0)，用前新鮮混合。
5)lmg/mlEB
6) 抽提緩沖液：0.35mol/L 山梨醇，50 mmol/LTris-HCl(pH8.0).5 mmol/LEDTA，0.1%BSA,0.25 mg/ml 精胺和亞精胺，儲存于用前加巰基乙醇至終濃度 0.2%。
7)4mol/L 硫氰酸胍：100 mmoI/LTris-HCl(pH7.5)，用前加巰基乙醇至 1%(終濃度），4°C 保存。
8)7.5mol/L 鹽酸胍：含 10 mmol/LDTT,NaOH 調至 pH7.5, 過濾 4℃ 保存
9)2mol/L 和 4mcL/LLiCl，4℃ 保存
10) 上樣緩沖液:50% 甘油，0.25% 溴酚藍，lmmol/LEDTA。
11)10XMOPS 緩沖液：0.4moI/LMOPS，0.lmol/L. 乙酸鈉，10 mmol/LNa2EDTA，pH7.0。
12)2mol/L 乙酸鉀：pH5.
13)2mol/L 乙酸鈉：pH7.5。
14)5% 十二烷基肌氨酸鈉。
15)TE 緩沖液：10 mmol/L—Tris-HCl(PH8.0)，1 mmol/LEDTA
16) 洗脫緩沖液：350 mmol/L 山梨醇，50 mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20 mmol/LEDTA
17) 勻漿器
二 操作方法
1. 線粒體的分離
所有步驟均在℃ 進行。溶液. 試劑瓶等要置于冰上。
1) 從油菜或其他植物中采集 4?6 周的新鮮綠色葉子 20 g. 剪碎，置于 200 ml 冰冷的抽提緩沖液中冷卻。
2) 在勻漿器中島速勻漿組織三次〔每次勻漿每次間隔 l0S)。用兩層濾膜將勻漿濾入 250 ml 冷的離心瓶中。
3)2000 g 離心過濾物 lOmin。小心地將上清液移入另一新管，10000 g 離心 20 min
4) 將沉淀再懸浮于 100 ml 柚提緩沖液中，重復步驟 3)—次。
5) 將線粒體沉淀再懸浮于 20 ml 冷的洗脫緩沖液中
6) 將每 10 ml 線粒體懸浮液，小心地置于蔗糖梯度的上面（蔗糖梯度組成為：9 ml0.9mol/L，11 ml1.5mol/L,9 ml1.75mol/L，蔗糖溶于洗脫緩沖液中）8O000 g 離心 60 min. 用寬孔吸管從 0.9mol/L 和 1.5mol/L 蔗搪界面 (黃帶）收集線粒體，用 5 倍的洗脫緩沖液稀釋 15?20 min
7)10000 g 離心 20mim 沉淀線粒體。將線粒體沉淀再懸浮于 1 ml 冷的洗脫緩沖液中。
2. 線粒體 RNA 的分離
1) 將線粒體與 20ug/ml 核糖核酸酶 A 于冰上共同孵育 60 min
2) 向線粒體中加入 5 倍體積的 4mol/L 硫氰酸胍。60s 后室溫下加入 0.5 倍體積的 5% 十二烷基肌氨酸鈉，混勻。5000 g,5 min 離心混合物，除去不溶件殘余物。
3) 將每 3.2 ml 混合物置于 1.lmlDEPC 處理的 5.7mol/LCsCl 溶液中。
4)22000 g 超速離心 14 h。
5) 仔細吸出上清液，并將與勻漿接觸的離心管的上部切除 (所有步驟應避免手上的核糖核酸酶 A 的污染）
6) 加人 lml7.5mol/L 鹽酸胍，充分混勻，溶解 RNA 沉淀。
7) 混合物內加入 0.05 倍體積的 2mol/L 乙酸鉀（PH5.5) 和 0.5 倍體積的乙醇。
8)?20℃ 孵肓 4 h.5000 g 離心 lOmin，沉淀線粒體 RNA
9) 加入 0.1 倍體積的 2moL/L 乙酸鈉 (pH7.0) 和 2.5 倍體積的乙醇，-20℃ 過夜，10000 g 離心 30 min。
10) 用 70% 乙醇洗滌線粒體 RNA, 真空干燥，溶解于 0.5 mlTE。
11）為獲得不含單鏈 DNA 的線粒體 RNA, 加入等體積的 4mol/LLiCl 溶解 RNA,4℃ 孵育過夜，10000 g 離心 20 min. 用 2mol/LiC1 洗滌一次，70% 乙醇洗滌兩次。
12) 真空干燥線粒體 RNA, 溶解于 DEPC 處理過的水中。測量 260nm 的吸光度佔算線粒體 RNA 的得率 n
13) 為長期儲存，在線粒體 RNA 中加 0.3 倍體積的乙酸鈉，2.5 倍體積的無水乙醇, 存放于每克新鮮葉子可提取 0.3?0.5ug 線粒體 RNA.
收起 |
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| 注意事項 | 1) 操作過程中戴塑料或乳膠手套，所有試劑僅用于 KNA 提取，避免核糖核酸酶的污染。所有的玻璃器皿在 160℃ 處理 4 h。所用的塑料器皿用硫氰酸胍處理后，浸于 0.2%DEPC 水中 12 h, 高壓消毒。
2) 為蔗糖梯度離心準備的梯度液應 4℃ 過夜平衡。梯度離心后，將洗脫緩沖液緩慢加人到收集到的線粒體中（15?20mim), 這可減少滲透性休克。
3) 由于單鏈 DNA 與 RNA 在梯度中同時沉淀下來，所以要獲得純化的 RNA 必須進行 2moL/LiC1 沉淀
4) 可直接用純的甲酰胺試劑。若出現黃色, 用 5%（m/V) 樹脂 501-X8(D)(BioRad) 處理 lh 以去除離子。過濾后的去離子甲酰胺應儲存在-70°C |
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