實驗概要
本實驗應用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)技術對提取的2D大鼠視網膜組織蛋白進行分離，獲得了分辮率高和重復性好的2DE圖像，建立了2DE分離技術的平臺，為進一步研究莫定了基礎。
實驗步驟
1. 清洗器具用品：清洗所有的干膠條套件，包括膠條槽、蓋片、托盤等。用Ettan IPGphor膠條槽清洗劑(Amersham Biosciences.)，并用大量去離子水沖洗，自然干燥備用。
2. 第一向等電聚焦電泳
1) 加樣和IPG干膠條再水化：采用樣品加在再水化液中方法進行加樣。24cm IPG膠條(PH3 -10Non-line )。銀染蛋白質上樣量為40ug-50ug。根據上樣量計算出樣品上樣的體積，加入樣品水化液，使總體積為450ul，充分混勻。將液體平鋪在膠槽內。取24cmIPG干膠條，從酸性端(尖端)一側剝去膠條保護膜，膠面向下，先將陽性端(尖端)放入膠條內，慢慢下壓膠條，避免產生氣泡，最后放下膠條平端(陰極端)，使水化液浸濕整個膠條，并確保膠條兩段和膠槽兩端電極接觸。在膠條上覆蓋植物油，蓋上蓋子。
采用再水化同時上樣的方法。低電壓再水化的步驟編為利用Ettan IPGphor進行電泳的第一步，再水化時間為12小時。
2) 設置等電聚焦電泳條件：在Ettan IPGphor等電聚焦設備上采用再水化同時上樣方法進行IPG等電聚焦。再水化和等電聚焦溫度均為20℃，電流最強上限為每膠條50uA，再水化時間12h。
第一步再水化： 30V 6h
60V 6h
第二步： 500V 1h
第三步： 1000V 1h
第四步： 8000V 20h
結束：8000V， 64，000Vh。
3. IPG膠條平衡：兩步平衡
第一步平衡：IPG膠條分別放入試管內，支持膜貼著管壁。加入10 ml含有DTT的平衡液。每10 ml平衡緩沖液中加入100 mg DTT，用蓋子蓋住試管或用封口膜封住試管，將其平放在搖床上，平衡15分鐘。
第二步平衡：用含碘乙酞胺的平衡溶液(不含DDT)進行第二步平衡，在每10mlSDS平衡緩沖液中加入250 mg碘乙酰胺。
4. SDS-PAGE
1) 配膠：12.5%均一SDS聚丙烯酰胺凝膠，單塊膠總量100 ml。
2) 灌膠：將配制好的膠液灌入模具中，至頂部3 cm左右。膠面上加入水飽和正丁醇20ul/塊。2小時后，可以使用。觀察凝膠，確保聚合反應均勻完全，凝膠內部沒有氣泡，并且凝膠的頂部表面平展。倒掉覆蓋在凝膠上的溶液，用凝膠儲存液沖洗凝膠表面。
3) 放置IPG膠條和加入分子量標準蛋白：將平衡后的膠條，放置于凝膠的頂部。加入分子量標準蛋白：將上樣濾紙片剪成約1 X 2 mm2，放在玻璃板上，分子量標準蛋白與等體積的1%瓊脂糖混勻，溶液加到上樣濾紙片上。用鑷子將上樣濾紙片放置在IPG膠條末端一側(右側)的凝膠表面。
4) 瓊脂糖封膠液固定IPG膠條： 0.5%瓊脂糖水浴加溫，在100℃條件下，使每管瓊脂糖封膠液融化大概需要10分鐘。當封膠液達到60℃時(用手能拿住)，緩慢地吸取足夠量的密封液(每塊凝膠需要1-1.5 ml)將IPG膠條完全覆蓋。不要產生氣泡。
5) 電泳條件：起始設置2 W/gel，1 h；5 W/gel，1 h；然后以恒定功率15 W/gel，4-5 h，當澳酚藍指示條帶達膠面底端時結束電泳。
5. 銀染及結果分析：試劑配制如下：
取出凝膠板，剝膠，置于存有染液的托盤內在搖床上輕輕搖動。采用銀染方法。
1) 固定：凝膠置于固定液中(乙醇200 ml、乙酸50 ml、加去離子水至500 ml ) 1小時；
2) 敏化：換敏化液(硫代硫酸鈉1 g，醋酸鈉34 g、去離子水至350ml、乙純150ml)敏化30 min；
3) 水洗：倒出敏化液，用去離子水洗3次，每次5分鐘；
4) 銀染：置于銀染液(硝酸銀溶液1.25 g，加去離子水至500mI)中染色20分鐘；
5) 漂洗：用去離子水500 ml漂洗一次，2分鐘；
6) 顯色：加顯色液(無水碳酸鈉12.5 g加去離子水至500 ml，臨用前加甲醛200ul)，至蛋白點完全清晰顯現，背景干凈時為止。約5-10分鐘；
7) 終止二倒出顯色液，立即換終止液(乙二胺四乙酸二鈉7.3 g，加去離子水至500 ml ) 10 min，終止顯色；
8) 換水：去離子水500 ml飄洗2次，每次10分鐘；
9) 保存：在去離子水中保存留待掃描及圖像分析。
6. 凝膠掃描及結果分析：用UMAX掃描儀對凝膠進行掃描，并用Image Master 2D 5.0分析軟件對圖像進行分析。
注意事項
1. 戴手套清洗，不用手接觸膠條槽。膠條槽在使用前必須完全干燥。
2. 將所有凝膠模具(電泳槽、玻璃板、厚玻璃板、塑料薄片)、試管、染色用托盤和量筒用去污劑軟刷刷洗(用力擦，把膠漬擦干凈)，避免其他蛋白質污染和以往實驗殘留物。去離子水反復沖洗兩遍，自然干燥。
附 件 (共1個附件,占30KB)
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