2.6真菌總RNA的制備

酚氯仿異戊醇 12mol L 氯化鋰3mol L 乙酸鈉乙醇DEPC 處理的水

水浴低溫高速離心機

一 材料與設備

1) 酚：氯仿：異戊醇 (25：24:1)。

2) 氯仿：異戊醇 (2：1)

3)12mol/L 氯化鋰。

4)3mol/L 乙酸鈉。

5)70% 乙醇。

6)DEPC 處理的水

7) 水浴。

8) 低溫高速離心機。


二 操作方法

1) 在裝有液氮的研缽中研磨 2?5 g 真菌組織，直至完全變成粉末。

2) 把研磨好的粉末轉移到 Falcon 管中，管中裝有提取緩沖液 (每克真菌用 3 mL 提取緩沖液）及等體積酚：氯仿：異戊醇 (預熱到 65℃）

3) 振搖試管以徹底混合。

4) 把混合物轉移到一個無 RNase 的離心管中，以 13000?18000 g 于 4℃ 離心30 min

5) 收集上層水相，加入等體積的氯仿：異戊醇 (24:1)，翻轉混勻。

6) 以 1300?18000 g 于 4°C 離心 30 min。

7) 收集上層水相，加入 12mol/L 氯化鋰至終濃度髙于 2mol/L。

8) 混合后于 4℃ 過夜以沉淀 RNA,

9) 以 13000?18000 g 于 4℃ 離心 30 min

10) 去上淸，以 5 ml3mol/L 乙酸鈉 (pH5.2) 清洗沉淀，按第 9) 步離心 15 min

11) 去上清. 以 20 ml70% 乙醇清洗沉淀，再按第 9) 步離心 I5 min。

12) 用 70% 乙醇重復冼滌一次。

13) 真空干燥以去除乙醇，

14) 以適當體積（250?lOOOul)DEPC 處理的水溶解沉淀。

15) 溶解的 RNA 于-70°C 保存。

1) 將研磨好的真菌轉移到 Falcon 管中時，要小心操作以避免損失. 所有操作都應該迅速，樣品/試管盡暈放在冰上以降低 RMase 的作用。

2)65℃ 加熱可幫助 RNA 溶解。如果有不溶顆粒，可于 13000?18000 g 離心 2 min, 收集上清，沉淀中部分或極少含有 RNA 或不含RNA.