痘苗病毒系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體 T7 RNA 聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶啟動子（PT7）的控制下。應用脂質體轉染，重組質粒進入感染了 vTF7-3 的細胞質中，而 vTF7-3 是一種能編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒（見「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。對于大規模的工作，PT7 操縱的基因可以通過同源重組插入另一個重組痘苗病毒中，使之與 vTF7-3 共同感染懸浮細胞（見「兩種重組痘苗病毒共感染細胞」）表達的蛋白質可以用脈沖標記的方法或用「重組痘苗病毒及其產物的鑒定實驗」中敘述的方法分析鑒定，用「離子交換層析實驗」描述的方法純化。重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染實驗方法原理......閱讀全文
痘苗病毒純化實驗
實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞或 BHK-21 細胞代替 HeLa 細胞。實驗材料 痘苗病毒儲液HeLa S3 細胞（懸浮培養）試劑、試劑盒 胰酶Tris ? Cl蔗糖儀器、耗材 旋轉
痘苗病毒純化實驗
大規模純化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞
痘苗病毒純化實驗
痘苗病毒通常采用蔗糖密度梯度離心的方法純化。純化的病毒可用于制備痘苗病毒 DNA ，用于不允許存在感染細胞蛋白污染的研究中，同時也可以用作高滴度的病毒儲液。對于大規模的純化（至少 1 L 的培養物），最好的方法是用 HeLa 細胞懸液作為感染的對象，而不要用單層培養的細胞。內容來源于《精編分子生物學
痘苗病毒儲液制備
實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒 試劑、試劑盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶 儀器、耗材 Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱 實驗步驟 1. 用血細胞
痘苗病毒DNA提取實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒
痘苗病毒儲液制備
基本方案 噬斑分析測定滴度 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3
痘苗病毒DNA提取實驗
如果提取的痘苗病毒DNA用于轉染，則應在蛋白酶 K 消化和苯酚抽提后分離。具體方法見本實驗。實驗材料純化的痘苗病毒試劑、試劑盒Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材分光光度計Sorval
痘苗病毒DNA提取實驗
實驗方法原理 實驗材料 純化的痘苗病毒試劑、試劑盒 Tris?Cl 溶液SDS蔗糖溶液 蛋白酶 K用 50 mmol／L Tris ? Cl 溶液平衡的苯酚1：1苯酚氯仿1 mol／L 乙酸鈉乙醇儀器、耗材 分光光度計Sorvall 離心機實驗步驟 1. 在 260 nm 處確定純化的疸苗病毒的光密
痘苗病毒儲液制備
實驗方法原理 實驗材料 懸浮培養的 HeLa S3 細胞痘苗病毒試劑、試劑盒 完全 MEM-10 和 MEM-2.50.25 mg ml 胰酶儀器、耗材 Sorvall H-6000A 轉子150 cm2 組織培養瓶CO2 培養箱實驗步驟 1. 用血細胞計數器對懸浮培養的 HeLa S3 細胞進行細
痘苗病毒系統基因表達實驗
重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染 兩種重組痘苗病毒共感染細胞 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本方案從構建外源基因位于 PT7 和 T7 終止子之間的質