細胞裂解分析化學,論壇,化學分析,儀器分析,分析測試,色譜,電泳,光譜u5kLlIO
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采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質分析化學論壇~O/b:te}
相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。
不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
2、如何得到比較純的包涵體
對于包涵體的純化，包涵體的前處理是很重要的。
包涵體中主要含有重組蛋白,但也含有一些細菌成分,如一些外膜蛋白、質粒DNA和其它雜質。洗滌常用1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇等反復多次進行，因去垢劑洗滌能力隨溶液離子強度升高而加強，在洗滌包涵體時可加50 mM NaCL。這樣提取的包涵體純度至少可達50%以上，而且可保持元結構。也可用低濃度的鹽酸胍或尿素/中性去垢劑/EDTA/還原劑等洗去包涵體表面吸附的大部分不溶性雜蛋白。洗滌液pH以與工程菌生理條件相近為宜，使用的還原劑為0.1-5mM。EDTA為0.1-0.3 mM。去垢劑如Triton X-100、脫氧膽酸鹽和低濃度的變性劑如尿素充分洗滌去除雜質,這一步很重要,因為大腸桿菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵體的溶解和復性過程中可導致重組蛋白質的降解。
1.2.5 DNA片段分析 SGC-7901感染Ad-p27mt和Ad-LacZ 48 h后離心去上清, 在剩余細胞沉淀中加500 mL的細胞裂解液(10 g/L Np40, 20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)]和10 mL蛋白酶K. 在56℃水浴中加熱1-2 h, 用苯酚和氯仿提取, 然后用脫水酒精沉淀DNA. 在700 mL/L酒精洗滌一次后加入200 mL TE. 然后再加入RNA酶(最終濃度為50 mL/L), 37℃下過夜. 然后在10
1.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 1×106細胞在含50μg/ml順鉑的培養液中培養12h，離心沉淀后，加入細胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），離心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，50℃孵育2h，再加入RNase A室溫放置1h。酚、氯仿抽提，取10μl DNA， 70℃放5min后，15ｇ/Ｌ瓊脂糖凝膠，4V/cm電泳3h，觀察結果并照像保存。
一、反復凍融法：
1、將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
2、至少3次以上凍溶。
3、IFCC推薦法：
收集細胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-200C 冷凍30 min，370C 解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液。
4、用液氮凍融三四次就可以了，細胞凍住后，取出放37度水浴，溶解后震蕩，再凍
二、超聲波處理法
1、要設定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間，這些都有利于保護酶的活性。我的實驗超聲時間5秒、間隙時間10秒、工作次數20次。
2、每個樣本超聲時間5秒,每個間隔5秒,粉碎5次。
3、100ml菌液離心，用8ml緩沖液懸浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超聲處理。750W 40％功率。5秒超聲，9秒間隔。超聲至少90min。
4、綜合凍融和超聲的方法：
1500g離心，棄除上清。冰上，用小體積PBS重懸細胞。
將重懸液集中，1500g離心濃縮，棄除上清。液氮驟冷。用約5倍體積的PBS緩沖液重懸細胞，并攪拌。
可選擇：4℃下超聲破碎細胞。加入終濃度為0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min離心裂解液。取出上清。過柱子。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol
三、滲透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA處理，冰浴放置10min。
《精編分子生物學實驗指南》
四、裂解液處理法：
1、細胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油。SDS是陰離子型表面活性劑、極易促溶、強變性作用。
2、在loading buffer加SDS，100度5分鐘，是變性方法。SDS與蛋白等量結合，可以通過條帶位移判斷蛋白大小，考染不會影響結果。
3、如果是做小量菌液，跑PAGE膠看其表達情況的話，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分鐘即可，需注意的是上樣前要離心12000rpm至少5分鐘，然后上樣時，槍頭別吸最底下的。